1.实验目的:THP-1慢病毒感染(CRISPR-Cas9体系,两步法)。第一步,LentiCas9慢病毒感染,让WT THP-1表达Cas9蛋白,通过Blasticidin(BSD)加压筛选;第二步,LentiGuide慢病毒感染,让THP-1(表达Cas9)表达sgRNA,通过Puromycin(Puro)加压筛选,从而得到目的基因敲除的THP-1 KO细胞株。
THP1的慢病毒感染 4.提前4-5天复苏THP1,不要临时抱佛脚提前1天复苏,这样的状态不太行。细胞状态好的THP1是感染成功的关键。THP1复苏后把它丢在一边不要管他,笔者一般加6ml 1640全培。这里有个细节,水浴锅解冻后直接加入1640培基中,不要再去离心去除冻存液然后重悬这个操作了,THP1 不喜欢反复离心。 等到第4...
首先,THP1细胞是个密度依赖性很强的细胞系,低密度生长会抑制,高密度则会疯狂生长。所以,控制好密度非常重要。如果实验室条件允许,最好做个细胞计数来确定转染细胞的用量。一般来说,50-100万/ml是它的合适生长密度,但转染时建议取20万-30万/ml左右的密度。我试过很多次,即使没有做细胞计数,只要THP1细胞状态好,...
构建慢病毒表 达载体 pHR— L IL RB5, 与 p8. 91 和 pMD 共 同转入 293T 细胞 ,产生 标记有绿色荧光 的 L ILR B5 慢病毒 , 感染 单核细胞系 T HP一 1后 通过流式细胞 术检测 L IL RB5 的表达 。 示真核表达 载体 pE G FP— L ILR B5一 flag 的序列与预期相 符, 瞬时转染 pE GFP -L...
将重组病毒感染人单核巨噬细胞(THP-1),通过荧光显微镜观测GFP表达量,结果表明获得了70%以上阳性细胞株。对细胞进行LPS诱导,分别收集pGCSIL-GFP-PLIγ和空病毒转染后72h的THP-1细胞,通过Real-time PCR方法检测sPLA2 ...
·天然免疫分子LILRB5慢病毒稳定转染THP-1细胞系的构建*王希娣1,2,张之勇2,任霞2,宋冠华2,禹林昌2,史美艳2,袁晓芬2,郭强2,李莲莲2,张晓瑜2,姜国胜1,2**(1.济南大学医学与生命科学学院,山东济南250022;2.山东省医学科学院基础医学研究所,山东济南250062)【摘要】目的构建天然免疫分子LILRB5的慢病毒表达载体...
目的:构建过表达Ⅲ型纤连蛋白结构域包含蛋白5(fibronectin typeⅢdomain-containing protein 5, FNDC5)基因的慢病毒载体,获得稳定转染FNDC5的THP-1细胞系.方法:PCR扩增目的基因FNDC5,将目的基因构建入pLenti-EF1a-EGFPP2A-Puro慢病毒载...
使用Lipo-fectamine2000,将慢病毒载体pGC.Fu—IK6.GFP转染293T细胞,测定病毒滴度后转染THP1细胞株,用流式细胞仪检测转染效率,RT—PCR检测靶细胞内IK6mRNA表达,Westernblot检测IK6.GFP融合蛋白,进一步观察THP1生物学特征的改变。结果表明,利用RT.PCR方法获得IK6目的基因并连接到线性化的慢病毒载体上,成功构建具有...
3、一种慢病毒转染技术构建cd226分子高表达的thp-1细胞系的方法,其特征在于,包括以下步骤: 4、步骤1、慢病毒感染 5、1)对过表达cd226进行绿色荧光蛋白标记; 6、2)将thp-1细胞接种于六孔板,使其细胞密度达到80%; 7、3)提前1h更换新鲜的rpmi1640完全培养基; ...
我们前期研究发现蛇毒sPLA2结构上与人sPLA2高度相似,具有相同的结构域,因此蛇体内的sPLA2抑制剂(sPLA2 inhibitor,PLI)很有可能具有抗人sPLAa-AA炎症途径作用.本文在华游蛇中克隆了一个PLIγ新基因,并构建慢病毒载体pGCSIL-GFP-PLIγ.将重组病毒感染人单核巨噬细胞(THP-1),通过荧光显微镜观测GFP表达量... 查看...