1.简介 简单回顾测序技术的发展,从Sanger发明双脱氧末端终止法(一代测序)到人类基因组计划历时13年耗费30亿美元,测序一直很贵,直到高通量的边合成边测序技术(二代测序)出现。随着测序价格的不断下降,2009年开发出了第一个单细胞转录组测序方法。 经过8年多时间的发展,如今不同的scRNA-seq流程有了大量改进,它们一...
3scRNA-seq的样品制备 3.1 经典protocol 通常来说,经典的scRNA-seq的protocol可以分为以下几个步骤: 从组织和细胞培养中制备细胞悬浮。 细胞筛选(基于表面marker、转基因技术、染色等)。(可选步骤😊) 捕获单个细胞(如wells,oil droplets)。 从每个细胞中提取RNA。 将RNA反转录为cDNA。 扩增cDNA(体外转录或 PCR)...
通常来说,经典的scRNA-seq的protocol可以分为以下几个步骤: 从组织和细胞培养中制备细胞悬浮。 细胞筛选(基于表面marker、转基因技术、染色等)。(可选步骤) 捕获单个细胞(如wells,oil droplets)。 从每个细胞中提取RNA。 将RNA反转录为cDNA。 扩增cDNA(体外转录或 PCR)。 准备测序文库,adapters。 测序。 处理raw ...
通常来说,经典的scRNA-seq的protocol可以分为以下几个步骤: 从组织和细胞培养中制备细胞悬浮。 细胞筛选(基于表面marker、转基因技术、染色等)。(可选步骤😊) 捕获单个细胞(如wells,oil droplets)。 从每个细胞中提取RNA。 将RNA反转录为cDNA。 扩增cDNA(体外转录或 PCR)。 准备测序文库,adapters。 测序。 处理...
如果对研究不同剪接体的表达感兴趣或研究不同的转录本,由于标签是有限的,不可能全部标记完这些转录本,那么全长的转录本定量就更合适 基于10X genomics技术的分析--测更多的细胞 如果想要分析组织中的成分,那么微滴技术可以提供数量可观的细胞 UMIs只适用于tagged protocol,更有利于稳定定量基因水平的表达编辑...
现有的统计模型几乎都假设scRNA-seq是对单个细胞中mRNA分子的随机抽样,然而,尤其是当数据来自不同单细胞protocol时,真实的抽样率却呈现基因特异性偏倚。当涉及到跨样本差异表达分析时,如果样本来自同一建库测序方法,一般来说,这种基因特异性的抽样偏倚就影响不大;反之,跨平台样本的差异表达分析就会出现问题。
一些单细胞RNA-seq protocol具有较短的reads长度,这也意味着不可能计算出来哪种isoform来自read。 Kallisto的伪模式采用略微不同的伪比对方法。Kallisto不是与isoform比对,而是与等价类(equivalence classes)比对。本质上,这意味着如果read比对到多个isoform,Kallisto将read记录为比对到一个包含所有此read比对到的isoform的...
一些单细胞RNA-seq protocol具有较短的reads长度,这也意味着不可能计算出来哪种isoform来自read。 Kallisto的伪模式采用略微不同的伪比对方法。Kallisto不是与isoform比对,而是与等价类(equivalence classes)比对。本质上,这意味着如果read比对到多个isoform,Kallisto将read记录为比对到一个包含所有此read比对到的isoform的...
然而,使用 独特分子标识符(UMI)的 protocol 通常包含一个带有细胞和 UMI barcode 和 adapters 但没有任何转录序列的 read。因此,尽管实际 上是成对末端测序,但 reads 将被比对为好像它们是单端测序的。 FastQ 文件的格式如下: >ReadID READ SEQUENCE
Pipeline:http://mccarrolllab.org/dropseq/ Tool:https://github.com/ggjlab/mca_data_analysis/tree/master/preprocessing/Drop-seq_tools-1.12/ 4. Protocol和操作视频 https://bis.zju.edu.cn/MCA/index.html 扫码后在手机中选择通过第三方浏览器下载...