RIP,全称为RNA Binding Protein Immunoprecipitation Assay,RNA 结合蛋白免疫沉淀,其主要目的是富集RNA分子和与之相互作用的蛋白质,以便进一步分析这些相互作用的性质和功能。RIP的基本步骤如下:① 交联: 首先,将细胞或组织样本进行交联,通常使用交联剂(如甲醛)处理,以稳定RNA和与之相互作用的蛋白质。② 细胞裂解: 细胞...
与传统的RNA-蛋白质相互作用分析技术相比,如RIP(RNA免疫沉淀)和CLIP(交联免疫沉淀)等,TREX技术在几个关键方面展现出显著优势: 特异性高:TREX技术通过特定的DNA探针直接靶向RNA序列,避免了非特异性背景的干扰,提高了实验的特异性和准确性。 灵敏度高:利用RNase H酶的高效率降解机制,TREX能够从大量非特异性蛋白中准确...
1.交联:首先,细胞或组织样品被处理以交联RNA和蛋白质的相互作用。通常使用交联剂如甲醛来固定RNA和蛋白质的结合状态。 2.细胞裂解:交联后,细胞或组织样品会被裂解,使得RNA和蛋白质释放到溶液中。 3.免疫沉淀:接下来,在细胞裂解产物中加入针对目标蛋白质的抗体,通过抗体与蛋白质的特异性结合,将目标蛋白质及其结合的...
近日,来自德国分子生物学研究所的Petra Beli团队以K6-linked ubiquitylation marks formaldehyde-induced RNA-protein crosslinks for resolution为题在Molecular Cell杂志发表了其最新的研究成果,他们发现甲醛能够诱导RNA-蛋白质交联物(RNA-protein crosslinks,RPCs)并停滞核糖体,抑制蛋白质翻译。另外,在mRNA上的RPCs能够核糖体...
近日,来自德国分子生物学研究所的Petra Beli团队以K6-linked ubiquitylation marks formaldehyde-induced RNA-protein crosslinks for resolution为题在Molecular Cell杂志发表了其最新的研究成果,他们发现甲醛能够诱导RNA-蛋白质交联物(RNA-protein crosslinks,RPCs)...
即使RNA和蛋白质在空间上离得很近，但没有直接物理结合，通常不会被有效地紫外交联起来。这是因为紫外...
RNA-seq的主要重点在于分析样品中现存的mRNA的种类和数量,但是mRNA的存在并不直接对应于蛋白质的产生。两种方法-多聚核糖体图谱 (polysomal profiling)和Ribo-seq技术允许我们跳出转录研究翻译组。核糖体翻译mRNA是受到高度调控的,蛋白质水平主要由翻译活性决定。Polysomal profiling和Ribo-seq帮助研究一个转录本上结合了多...
如果RBP结合的RNA区域缺乏尿嘧啶,那么交联以及之后所有的实验都不会成功。2)由于技术限制,UV介导的RNA与蛋白交联目前很难用于鉴定蛋白质上具体结合RNA的氨基酸位点。3)另外,UV的光学特点使得这种交联策略基本不能用于多细胞生物的体内研究上。 为了克服以上缺点,Lei Wang课题组开发了一项名为可遗传编码的体内RNA化学...
2. RNA提取:将交联后的细胞进行裂解,提取RNA,使用biotin化寡核苷酸探针进行RNA的寡核苷酸捕获。 3.免疫共沉淀:将biotin化的RNA探针与细胞提取物进行共沉淀,使用带有亲和标签的抗体捕获RNA-蛋白质复合物。 4. 洗涤和纯化:将共沉淀物进行洗涤,去除非特异性结合的RNA和蛋白质。然后使用热水解的方法将RNA-蛋白质交联断...
作者首先构建了带有V5标签的PRC2蛋白质，将其表达在细胞中，然后将这些细胞的裂解物与未表达V5标签蛋白的细胞裂解物混合。通过紫外线交联将RNA和蛋白质形成共价联系，然后进行高强度的洗涤和纯化，以确保只有直接与PRC2相互作用的RNA被保留和分析（eCLIP）。分析两种细胞源的RNA与PRC2的结合情况发现，即使是在严格的...