1、m6A-IP-qPCR m6A-IP-qPCR也叫MeRIP-qPCR,即利用m6A抗体在富集到带甲基化修饰的RNA后,下一步使用qPCR直接对富集到的RNA进行定量的一种技术。 其次,我们知道m6A修饰的过程离不开甲基转移酶(writer)、去甲基转移酶(eraser)和阅读蛋白(reader)的作用,如下图展示了与m6A修饰作用相关的各种RNA结合蛋白: 所以RNA-...
m6A修饰RNA表达水平定量检测(MeRIP-qPCR)是将RNA免疫共沉淀与荧光定量PCR相结合的技术,通过特异性抗体富集total RNA中发生m6A甲基化修饰的RNA,借助特异性引物实现对m6A修饰的mRNA、lncRNA或circRNA进行定量的目的,可以应用于经MeRIP-seq发现的m6A修饰的基因(或已知的某个靶基因)在组间样本中m6A修饰水平的差异验证。
与普通的qPCR有所不同,MeRIP-qPCR是验证某个目标基因上的某个修饰位点(以一小段区域的形式,MeRIP法精确不到单碱基)的修饰水平。得到的结果往往是一个%(IP/Input)的数值,它体现的是该位点的修饰水平(目标基因发生该修饰的转录本占该基因总转录本的比例),而普通qPCR验证的是某个基因的表达水平(共表达了多少转录...
1、m6A-IP-qPCR m6A-IP-qPCR,也叫MeRIP-qPCR,即m6A抗体富集到带甲基化修饰的RNA,下一步使用qPCR直接对富集到的RNA进行定量的一种技术。 二、m6A相关蛋白结合验证 m6A修饰的过程,离不开甲基转移酶(writer)、去甲基转移酶(eraser)和阅读蛋白(reader)的作用。如下图,展示了与m6A修饰作用相关的各种RNA结合蛋白: ...
我们先进行一个简单的计算,常规的RT-qPCR 1个反应(1个复孔)需要的total RNA至少0.1-1ug左右。我们按照最小反应起始量来算的话,那么1个反应需要至少100ng的total RNA,3个技术重复(3个复孔),总计total RNA为300ng。 我们知道totalRNA中绝大部分为rRNA,那么只有不到5%的RNA为我们需要研究的对象。PCR反应需要引...
所谓m6A-IP-qPCR也叫MeRIP-qPCR,即利用m6A抗体在富集到带甲基化修饰的RNA后,下一步使用qPCR直接对富集到的RNA进行定量的一种技术。 这种技术可以做到对发生甲基化的RNA进行相对定量,是一种低成本的检测方法,仅需m6A抗体,A/G免疫磁珠,磁力架和qPCR仪及配套试剂盒即可开展这类实验。
辅助材料——m6A-IP-qPCR不打断直接对total RNA进行IP富集的实验步骤 a.实验前期准备 在进行实验之前,在前期请仔细核对以下信息。在确保任何试剂耗材和仪器设备没有问题情况下,再开展后续实验。 仪器设备 冷冻离心机、磁力架、PCR仪、水浴锅、震荡金属浴、超净工作台和垂直混匀仪等 ...
图6:qPCR分析表明,冷富集m6A转录本与RNA丰度以及核糖体占有率之间存在潜在相关性。在Col-0和mta中,候选CBF和COR基因的相对mRNA丰度和多聚体负载的变化通过对照和低温条件下的倍数变化来分析。 关于易基因RNA m6A甲基化测序(MeRIP-seq)技术 易基因MeRIP-seq技术利用m6A特异性抗体富集发生m6A修饰的RNA片段(包括mRNA、...
为了量化GSC中AHA修饰的新生CLIP3的量,miRNA诱导胶质瘤干细胞分化过程中m6A的丢失和翻译的增加,使用针对CLIP3和生物素的抗体进行了邻近连接试验。表明在GSC差异分化过程中,CLIP3的初生翻译显著增加。接下来,定量了GSC分化后CLIP3 m6A RNA的水平。m6A RIP和CLIP3 qPCR显示CLIP3转录本m6A显著去甲基化。
首先，如果需要对m6A修饰位点进行严格的验证，可以用下面这个方法：m6A-IP-qPCR ，也叫MeRIP-qPCR，即 m6A抗体富集到带甲基化修饰的RNA，下一步使用qPCR直接对富集到的RNA进行定量 的一种技术。m6A修饰的过程，离不开 甲基转移酶（writer）、去甲基转移酶（eraser）和阅读蛋白（reader） 的作用。如下图...