所谓m6A-IP-qPCR也叫MeRIP-qPCR,即利用m6A抗体在富集到带甲基化修饰的RNA后,下一步使用qPCR直接对富集到的RNA进行定量的一种技术。 这种技术可以做到对发生甲基化的RNA进行相对定量,是一种低成本的检测方法,仅…
我们从传统的RT-qPCR会发现,每个样本都要做一个内参基因,如上面提到的哺乳动物会选择GAPDH,而miRNA则会选择U6。那么我们的m6A-IP-qPCR 是不是也需要内参基因,根据我们查阅的大量文献来看,绝大部分是没有的,少量文献也会使用到内参基因或者我们称之为negative control gene。 那么是不是m6A-IP-qPCR 就真的没内参...
基于单碱基延伸和连接的qPCR扩增方法(SELECT)利用m6A阻碍DNA聚合酶和连接酶的事实,方便快速地检测m6A修饰及其在特定位点的程度(Xiao等人,2018)。SELECT使用DNA聚合酶和连接酶连接靶位点的两个互补DNA引物。在这个过程中,m6A首先干扰上游引物的延伸,然后阻碍下游引物的连接。尽管m6A不能以100%的效率抑制每一步,但通过两...
技术原理:类似MeRIP-Seq,不同点是:IP后通过定量PCR进行检测,适合于检测几个或几十个特定的靶点。 云序MeRIP-qPCR产品: 云序提供各类不同修饰的MeRIP-qPCR服务,可针对mRNA,lncRNA,环状RNA等不同类型的RNA分子进行检测(见下表)。客户无需准备抗体,节约了抗体采...
然后将两种构建好的质粒转化大肠杆菌,使用MeRIP-RT-qPCR和MeRIP-seq检测IPTG诱导前后的mRNA甲基化情况。dCas13-M3和dCas13-M3M14均能有效对RNA进行m6A编辑。测序结果显示两者的脱靶效率均在可控范围内,且与其甲基化活性相关。 Step 3:在人源细胞中验证系统对外源转录本的m6A编辑作用。
在☞RNA m6A检测方法一文中我们介绍了MeRIP-qPCR这种方法。在第四步中我们提到IP下来的RNA需要用随机引物进行逆转录,而第四步中设计的引物用的是特异性引物,这个大家要注意区分和甄别。有人可能会比较好奇,这个特异性引物是怎么设计的。首先我们需要确定m6A究竟发生在mRNA上的什么位置,接下来才能确定究竟应该在哪里放...
细胞功能包括敲低/敲除/过表达、蛋白细胞定位、蛋白与蛋白互作、蛋白与RNA/DNA互作、细胞表型实验(迁移侵袭、划痕、增殖、凋亡、周期)等。最后的动物实验主要指动物模型实验,如小鼠、斑马鱼等。除了qPCR外,接下来的内容中会选择其中几个高频的验证实验做介绍。
然后就是qPCR原理。接下来就是进入到了m6A-IP-qPCR的深水区,即富集mRNA→打断→IP→PCR几个步骤。最后就是群众们喜闻乐见的简单粗暴m6A-IP-qPCR大法(即不富集mRNA不打断按照常规PCR引物来进行设计)。再次提醒,还是请大家尽量不要直接翻到最后,耐心把前面的内容看完。
[0071] 3.8检测与验证 [0072] ①取1μL RNA样品Agilent 2100检测RNA浓度;②参考逆转录试剂盒说明书逆转录 RNA样品(IP、IgG及Input);③参考PCR试剂盒配置反应体系进行PCR,取3‑5μL PCR产物3% 琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果;④参考2×SYBR Green qPCR Mix试剂盒说明书配置20μ LPCR扩增体系进行qPCR,然后进行...