m6A-IP-qPCR的实验步骤包括RNA提取、m6A抗体富集、RNA打断、抗体孵育和特异性富集、洗脱和逆转录扩增以及设计m6A-IP-qPCR的特异性引物等关键步骤。其中,设计m6A-IP-qPCR的特异性引物是确保实验成功的关键之一。在设计过程中,研究人员需要充分考虑m6A修饰的特性和研究目的,确保引物能够特异性地扩增出含有m6A修饰
因此,我们需要对MeRIP-seq分析到的RNA修饰区段进行进一步的m6A修饰位点鉴定并定量位点修饰水平。或者,在没有测序之前,利用预测的m6A位点设计引物进行qPCR检测,以确定m6A水平在样本间具有差异。 今天,小编就给大家介绍一个预测目标区段是否具有m6A修饰位点以及位点具体位置的网站,为大家的MeRIP-qPCR或者SELECT实验保驾护航。
在m6A修饰位点上下游设计两个DNA探针:Up Probe和Down Probe(探针两端均带有固定序列,可成为最后的qPCR引物),探针与RNA退火杂交(m6A修饰位点形成gap); 用Bst DNA polymerase和dTTP(或dNTP)进行延伸反应(若该位点存在m6A修饰,则延伸效率会降低); 用SplintR ligase(该酶可以连接与RNA片段互补的两个ssDNA)进行连接反应(...
第三步，洗脱和逆转录扩增。接下来我们需要对m6A抗体和IgG抗体上洗脱下来的RNA，以及input的RNA，按照常规试剂盒要求进行洗脱，并用随机引物进行逆转录。第四步，设计m6A-IP-qPCR的特异性引物。由于m6A甲基化基本富集在UTR区和转录终止区，所以如上图所示在这些区域附近我们可以从测序结果里有明显的peak峰。那么我们...
在m6A修饰位点上下游设计两个DNA探针:Up Probe和Down Probe(探针两端均带有固定序列,可成为最后的qPCR引物),探针与RNA退火杂交(m6A修饰位点形成gap); 用Bst DNA polymerase和dTTP(或dNTP)进行延伸反应(若该位点存在m6A修饰,则延伸效率会降低); 用SplintR ligase(该酶可以连接与RNA片段互补的两个ssDNA)进行连接反应(...
因此,我们需要对MeRIP-seq分析到的RNA修饰区段进行进一步的m6A修饰位点鉴定并定量位点修饰水平。或者,在没有测序之前,利用预测的m6A位点设计引物进行qPCR检测,以确定m6A水平在样本间具有差异。 今天,小编就给大家介绍一个预测目标区段是否具有m6A修饰位点以及位点具体位置的网站,为大家的MeRIP-qPCR或者SELECT实验保驾护航...
设计MeRIP-qPCR引物以验证p65 mRNA上的m6A修饰。潜在的m6A位点以红色标出(上),MeRIP-qPCR引物用箭头表示。MeRIP-qPCR用引物#2和#3(较低)验证了m6A修饰。 YTHDF1-RIP测序分析结果表明,与IgG对照相比,p65 mRNA富集(左)。YTHDF1-RIP-qPCR的小鼠p65 mRNA特异性引物(右)。
第四步,设计m6A-IP–qPCR 的特异性引物。由于m6A甲基化基本富集在UTR区和转录终止区,所以如上图所示在这些区域附近我们可以从测序结果里有明显的peak峰。那么我们设计引物可以考虑在基因高甲基化区域来进行。如果某几个常见的基因在不同文献里频繁出现,那么文献里列出来的引物可以被我们直接拿来引用。通常最后PCR产物长...
设计MeRIP-qPCR引物以验证p65 mRNA上的m6A修饰。潜在的m6A位点以红色标出(上),MeRIP-qPCR引物用箭头表示。MeRIP-qPCR用引物#2和#3(较低)验证了m6A修饰。 YTHDF1-RIP测序分析结果表明,与IgG对照相比,p65 mRNA富集(左)。YTHDF1-RIP-qPCR的小鼠p65 mRNA特异性引物(右)。
设计MeRIP-qPCR引物以验证p65 mRNA上的m6A修饰。潜在的m6A位点以红色标出(上),MeRIP-qPCR引物用箭头表示。MeRIP-qPCR用引物#2和#3(较低)验证了m6A修饰。 YTHDF1-RIP测序分析结果表明,与IgG对照相比,p65 mRNA富集(左)。YTHDF1-RIP-qPCR的小鼠p65 mRNA特异性引物(右)。