m6A-IP-qPCR的实验步骤包括RNA提取、m6A抗体富集、RNA打断、抗体孵育和特异性富集、洗脱和逆转录扩增以及设计m6A-IP-qPCR的特异性引物等关键步骤。其中,设计m6A-IP-qPCR的特异性引物是确保实验成功的关键之一。在设计过程中,研究人员需要充分考虑m6A修饰的特性和研究目的,确保引物能够特异性地扩增出含有m6A修饰
第四步，设计m6A-IP-qPCR的特异性引物。由于m6A甲基化基本富集在UTR区和转录终止区，所以如上图所示在这些区域附近我们可以从测序结果里有明显的peak峰。那么我们设计引物可以考虑在基因高甲基化区域来进行。如果某几个常见的基因在不同文献里频繁出现，那么文献里列出来的引物可以被我们直接拿来引用。通常最后PCR产物...
1)MeRIP-qPCR的目的 与普通的qPCR有所不同,MeRIP-qPCR是验证某个目标基因上的某个修饰位点(以一小段区域的形式,MeRIP法精确不到单碱基)的修饰水平。得到的结果往往是一个%(IP/Input)的数值,它体现的是该位点的修饰水平(目标基因发生该修饰的转录本占该基因总转录本的比例),而普通qPCR验证的是某个基因的表达水...
所谓m6A-IP-qPCR也叫MeRIP-qPCR,即利用m6A抗体在富集到带甲基化修饰的RNA后,下一步使用qPCR直接对富集到的RNA进行定量的一种技术。 这种技术可以做到对发生甲基化的RNA进行相对定量,是一种低成本的检测方法,仅…
在m6A修饰位点上下游设计两个DNA探针:Up Probe和Down Probe(探针两端均带有固定序列,可成为最后的qPCR引物),探针与RNA退火杂交(m6A修饰位点形成gap); 用Bst DNA polymerase和dTTP(或dNTP)进行延伸反应(若该位点存在m6A修饰,则延伸效率会降低); 用SplintR ligase(该酶可以连接与RNA片段互补的两个ssDNA)进行连接反应(...
设计MeRIP-qPCR引物以验证p65 mRNA上的m6A修饰。潜在的m6A位点以红色标出(上),MeRIP-qPCR引物用箭头表示。MeRIP-qPCR用引物#2和#3(较低)验证了m6A修饰。 YTHDF1-RIP测序分析结果表明,与IgG对照相比,p65 mRNA富集(左)。YTHDF1-RIP-qPCR的小鼠p65 mRNA特异性引物(右)。
第四步,设计m6A-IP–qPCR 的特异性引物。由于m6A甲基化基本富集在UTR区和转录终止区,所以如上图所示在这些区域附近我们可以从测序结果里有明显的peak峰。那么我们设计引物可以考虑在基因高甲基化区域来进行。如果某几个常见的基因在不同文献里频繁出现,那么文献里列出来的引物可以被我们直接拿来引用。通常最后PCR产物长...
设计MeRIP-qPCR引物以验证p65 mRNA上的m6A修饰。潜在的m6A位点以红色标出(上),MeRIP-qPCR引物用箭头表示。MeRIP-qPCR用引物#2和#3(较低)验证了m6A修饰。 YTHDF1-RIP测序分析结果表明,与IgG对照相比,p65 mRNA富集(左)。YTHDF1-RIP-qPCR的小鼠p65 mRNA特异性引物(右)。
通过MeRIP-qPCR(RNA甲基化测序-qPCR)对mRNA和m6A进行测序用于确定ALKBH5对PER1的靶向作用; ❖ 通过ChIP和荧光素酶检测ALKBH5启动子中的p53结合位点,揭示ALKBH5与PER1激活的ATM-CHK2-P53/CDC25C信号通路之间的相互作用。 主要实验方法及结果 01 ALKBH5的损失...
在☞RNA m6A检测方法一文中我们介绍了MeRIP-qPCR这种方法。在第四步中我们提到IP下来的RNA需要用随机引物进行逆转录,而第四步中设计的引物用的是特异性引物,这个大家要注意区分和甄别。有人可能会比较好奇,这个特异性引物是怎么设计的。首先我们需要确定m6A究竟发生在mRNA上的什么位置,接下来才能确定究竟应该在哪里放...