第四步，设计m6A-IP-qPCR的特异性引物。由于m6A甲基化基本富集在UTR区和转录终止区，所以如上图所示在这些区域附近我们可以从测序结果里有明显的peak峰。那么我们设计引物可以考虑在基因高甲基化区域来进行。如果某几个常见的基因在不同文献里频繁出现，那么文献里列出来的引物可以被我们直接拿来引用。通常最后PCR产物长度会在
1)MeRIP-qPCR的目的 与普通的qPCR有所不同,MeRIP-qPCR是验证某个目标基因上的某个修饰位点(以一小段区域的形式,MeRIP法精确不到单碱基)的修饰水平。得到的结果往往是一个%(IP/Input)的数值,它体现的是该位点的修饰水平(目标基因发生该修饰的转录本占该基因总转录本的比例),而普通qPCR验证的是某个基因的表达水...
设计MeRIP-qPCR引物以验证p65 mRNA上的m6A修饰。潜在的m6A位点以红色标出(上),MeRIP-qPCR引物用箭头表示。MeRIP-qPCR用引物#2和#3(较低)验证了m6A修饰。 YTHDF1-RIP测序分析结果表明,与IgG对照相比,p65 mRNA富集(左)。YTHDF1-RIP-qPCR的小鼠p65 mRNA特异性引物(右)。 YTHDF1敲除的TNF/NF-κB信号通路关键效...
(1)通过m6A RIP-seq检测发现,在KIF26B基因的调控下,Hippo信号通路被显著地激活了(图15/c) (2)同时,作者在经METTL3敲除后的CRC细胞中进行了KIF26B基因的沉默,接着通过WB实验发现(图15/d,f),由METTL3敲除而引起的KIF26B基因的缺失会减弱CRC细胞的迁移 (3...
那么我们首先依旧是与传统的RT-qPCR相似,用相应的软件实时监测扩增曲线。溶解曲线必须是单峰,以保证引物特异性扩增。然后就是校准每一个样本的平均Ct值,以消除样本准备过程中的差异。 接下来我们就要开始对每个样本中,RIP和input的3个技术重复得到的Ct值计算平均值,再对3个生物学重复样本中的Ct平均值再去计算其Ct平...
设计MeRIP-qPCR引物以验证p65 mRNA上的m6A修饰。潜在的m6A位点以红色标出(上),MeRIP-qPCR引物用箭头表示。MeRIP-qPCR用引物#2和#3(较低)验证了m6A修饰。 YTHDF1-RIP测序分析结果表明,与IgG对照相比,p65 mRNA富集(左)。YTHDF1-RIP-qPCR的小鼠p65 mRNA特异性引物(右)。
设计MeRIP-qPCR引物以验证p65 mRNA上的m6A修饰。潜在的m6A位点以红色标出(上),MeRIP-qPCR引物用箭头表示。MeRIP-qPCR用引物#2和#3(较低)验证了m6A修饰。 YTHDF1-RIP测序分析结果表明,与IgG对照相比,p65 mRNA富集(左)。YTHDF1-RIP-qPCR的小鼠p65 mRNA特异性引物(右)。
在m6A修饰位点上下游设计两个DNA探针:Up Probe和Down Probe(探针两端均带有固定序列,可成为最后的qPCR引物),探针与RNA退火杂交(m6A修饰位点形成gap); 用Bst DNA polymerase和dTTP(或dNTP)进行延伸反应(若该位点存在m6A修饰,则延伸效率会降低); 用SplintR ligase(该酶可以连接与RNA片段互补的两个ssDNA)进行连接反应(...
第四步,设计m6A-IP–qPCR 的特异性引物。由于m6A甲基化基本富集在UTR区和转录终止区,所以如上图所示在这些区域附近我们可以从测序结果里有明显的peak峰。那么我们设计引物可以考虑在基因高甲基化区域来进行。如果某几个常见的基因在不同文献里频繁出现,那么文献里列出来的引物可以被我们直接拿来引用。通常最后PCR产物长...
接下来我们需要对m6A抗体和IgG抗体上洗脱下来的RNA,以及input的RNA,按照常规试剂盒要求进行洗脱,并用随机引物进行逆转录。 第四步,设计m6A-IP–qPCR 的特异性引物。由于m6A甲基化基本富集在UTR区和转录终止区,所以如上图所示在这些区域附近我们可以从测序结果里有明显的peak峰。那么我们设计引物可以考虑在基因高甲基...