💉 细胞裂解与蛋白溶解 由于LC3是脂化和膜相关蛋白,在细胞裂解时,可在冰上短暂超声,以促进蛋白溶解,使得LC3顺利从膜上解离。此外,LC3-II的分子量约16KD,LC3-I在电泳后停留在14KD处,两者均为小分子量蛋白,且差距仅2KD。因此在WB时要注意使用高浓度分离胶进行分离(建议约15%),转膜时使用小孔径0.2um的NC膜,...
上图MEF细胞在短时间的饥饿处理下(0.5h和2h),LC3-I减少,LC3-II增加;而在长时间饥饿下(4h和6h),LC3-I和LC3-II含量都减少了。 如果按照之前的LC3-II /LC3-I,可能会获得4h,6h自噬更强的结论,但事实上并不是这样的,通过加入溶酶体蛋白酶抑制剂如E64d和pepstatin A处理,我们可以得出结论,在0.5h自噬是最强的...
LC3-II 的含量和发生自噬的程度成正比，LC3-II/I比值的大小可估计自噬水平的高低。得益于荧光蛋白技术的发展，我们可以通过荧光蛋白标记的方式，直观的看到自噬现象和过程。自噬病毒工具，便于直接感染目的细胞后直观地观察细胞自噬的整体水平。自噬单荧光标记慢病毒 吉满自主研发出单荧光(绿光或红光)标记的自噬指示产品...
首先他们的结果表明LC3-II/LC3-I比例在PINK1高表达组中上调,提示了自噬增强,同时采用线粒体的标记物Mito20和LC3的共定位来验证线粒体自噬的发生,由于研究表明PINK1可以通过招募OPTN以及NDP52从而启动线粒体自噬,所以作者也对于线粒体上OPTN和NDP52的表达进行表征,发现PINK1高表达组这两个指标也是上调的,并且免疫荧光...
LC3 I是未修饰的形式,而LC3 II是经过磷酸化和脂化修饰的形式。LC3 II在自噬过程中会转移到自噬体膜上,因此LC3 II的水平可以反映自噬的活性。 2. 免疫印迹法:常用的检测LC3的方法是免疫印迹法。首先,需要制备细胞提取物,并使用蛋白质浓度检测方法确定提取物的蛋白质浓度。然后,将相同量的蛋白质加载到SDS-PAGE...
没办法,只能再去求助隔壁的师兄。师兄说LC3分子量比较小,只有16KD,在电泳的时候需要使用12%-15%的胶,避免跑过。转膜的时候需要使用0.22um的膜,缩短转膜的时间,40min即可。切莫使用0.45um的膜,否则量相对少的LC3I更不容易显出来。 经过师兄的指导,小优终于做出了条带。咦,我...
LC3-I和LC3-II存在一个生成-降解的动态过程。自噬小体有一个生成、融合、降解的过程,即“自噬流”。 所以,单时间点LC3-II的表达改变并不能体现自噬的改变,需要使用一些阻断溶酶体降解的药物(如氯喹、巴佛洛霉素A1等),判断在干预手段下,细胞的自噬程度...
LC3-I和LC3-II存在一个生成-降解的动态过程。自噬小体有一个生成、融合、降解的过程,即“自噬流”。 所以,单时间点LC3-II的表达改变并不能体现自噬的改变,需要使用一些阻断溶酶体降解的药物(如氯喹、巴佛洛霉素A1等),判断在干预手段下,细胞的自噬程度的改变。
没办法,只能再去求助隔壁的师兄。师兄说LC3分子量比较小,只有16KD,在电泳的时候需要使用12%-15%的胶,避免跑过。转膜的时候需要使用0.22um的膜,缩短转膜的时间,40min即可。切莫使用0.45um的膜,否则量相对少的LC3I更不容易显出来。 经过师兄的指导,小优终于做出了条带。咦,我这个为什么是一条带?别人文献中明明都...