💉 细胞裂解与蛋白溶解 由于LC3是脂化和膜相关蛋白,在细胞裂解时,可在冰上短暂超声,以促进蛋白溶解,使得LC3顺利从膜上解离。此外,LC3-II的分子量约16KD,LC3-I在电泳后停留在14KD处,两者均为小分子量蛋白,且差距仅2KD。因此在WB时要注意使用高浓度分离胶进行分离(建议约15%),转膜时使用小孔径0.2um的NC膜,...
上图MEF细胞在短时间的饥饿处理下(0.5h和2h),LC3-I减少,LC3-II增加;而在长时间饥饿下(4h和6h),LC3-I和LC3-II含量都减少了。 如果按照之前的LC3-II /LC3-I,可能会获得4h,6h自噬更强的结论,但事实上并不是这样的,通过加入溶酶体蛋白酶抑制剂如E64d和pepstatin A处理,我们可以得出结论,在0.5h自噬是最强的...
LC3-I的分子量约16KD,由于LC3-II接合了PE基团,理论上LC3-II的分子量比LC3-I更高。但是,由于带负电的PE改变了LC-II的性质,使其疏水性更强,导致其在电泳中迁移率更高,所以在SDS-PAGE中LC3-II显得分子量比LC3-I小。 LC3-I与LC3-II仅有2KD差异...
WB这个小优可擅长了,三下五除二,就借(骗)到了隔壁实验室的LC3抗体。 还是先查查LC3再做吧,LC3是一种蛋白轻链3,是自噬过程的标志物。它的功能主要参与了自噬小体的形成, LC3前体分子被ATG4B剪去C端的5肽,裂解形成胞质形式LC3-I。然后被APG7L / ATG7激活,转移至ATG3并偶...
如果你按照LC3-II/LC3-I来分析,可能会得出4h和6h自噬更强的结论,但实际上并不是这样。通过加入溶酶体蛋白酶抑制剂如E64d和pepstatinA处理后,我们发现0.5h自噬是最强的,后面逐渐减弱。 总结📝总的来说,解读LC3的WB结果需要综合考虑多个因素:蛋白酶体抑制剂的处理、抗体的选择以及细胞培养条件等。记住这些小细节,...
LC3-I通过Atg7 和 Atg3(分别对应 E1 和 E2 样酶)参与的泛素样反应,使磷脂酰乙醇胺 (PtdEth,PE) 偶联,生成脂质化形式的 LC3,也称作 LC3-II,它可以附着到自噬体(autophagosome)的膜上,是自噬体的结构蛋白。在降解过程中,位于自噬溶酶体外膜的LC3-II被半胱氨酸蛋白酶Atg4B移除后回收,位于内膜的LC3-II则与...
LC3-I的分子量约16KD,由于LC3-II接合了PE基团,理论上LC3-II的分子量比LC3-I更高。但是,由于带负电的PE改变了LC-II的性质,使其疏水性更强,导致其在电泳中迁移率更高,所以在SDS-PAGE中LC3-II显得分子量比LC3-I小。 LC3-I与LC3-II仅有2KD差异,在WB中需注意:建议使用高浓度分离胶(如15%)进行分离;转膜...
自噬形成时，胞浆型LC3（即LC3-I）会酶解掉一小段多肽，转变为（自噬体）膜型（即LC3-II），因此可利用WB检测LC3-II/I比值的变化以评估自噬的强弱。此外自噬衔接物如sequestosome 1（SQSTM1，也称为p62）也可用于检测自噬，p62蛋白水平的多少与自噬强弱有着反比例关系。2.3荧光蛋白标记检测 2.3.1 GFP-LC3 ...
LC3-I与LC3-II仅有2KD差异,在WB中需注意:建议使用高浓度分离胶(如15%)进行分离;转膜时,使用小孔径0.22um转印膜,湿转70V 1.5h,可用丽春红染色观察转膜效果。 部分推荐产品: 货号 产品名称 加入购物车 4599S LC3A (D50G8) XP® Rabbit mAb
这时隔壁热心的师兄告诉小优,想要观察自噬有没有参与,最简单的就是做下LC3的WB。WB这个小优可擅长了,三下五除二,就借(骗)到了隔壁实验室的LC3抗体。 还是先查查LC3再做吧,LC3是一种蛋白轻链3,是自噬过程的标志物。它的功能主要参与了自噬小体的形成, LC3前体分子被ATG4B剪去C端的5肽,裂解形成胞质形式LC3-I...