一、常规PCR PCR是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术,其中引物的好坏与PCR结果有密切关系。PCR不仅要求引物与靶DNA特异结合,还要求DNA聚合酶能对引物进行有效的延伸(图1)。 图1 PCR实验原理 ◆ 引物设计要遵循以下原则 ◆ 01.引物长度一般在15-30bp; 02.引物GC含量一般为40%-60%; 03.引物所对...
引物设计Tips 1. TF结合的区域通常是启动子,UTR这些A/T比例比较高的区域,因而如果设计出来的引物Tm值略低,也是正常的,只要可以保证引物的特异性,不必强求退火温度比Tm低5度。 2. qPCR的产物长度一般不要太长,80-150bp就可以,因为在ChIP实验中染色质被片段化,你的PCR扩增的片段越长,这段DNA被打断的可能性就...
从上图我们知道,这个引物可以扩增出很多产物。这个不重要,因为我们在收取组织或者细胞做chip的时候,是要将dna和蛋白质复合物进行超声,将dna打断的,所以我们只要打断dna再跑胶明确那些dna主要是500以下就行。这样,我们的引物就是非常特异了。那么,这一条引...
3、PCR的阳性引物对照：选做 4、Spike-in参照：选做 什么是ChIP spike-in？ChIP Spike-in指的是在一个ChIP实验中，在纯化富集得到的目的DNA片段混合液中掺入一定量的已知序列外源DNA片段（最常用的就是lambda噬菌体的DNA）用于整个实验的质控及标准化，后续的荧光定量PCR可以检测Spike-in，得到的Ct值可以作为内参...
如图,这个 ChIP-Seq 的数据的各个质控参数都还可以,PBC>82%,表明建库过程中没有 PCR bias。用 Phastcon 检测 ChIP-Seq 数据中结合位点的保守性,因为 TF 的 DNA 结合序列在物种间相对保守,这种中间峰值最高,两边对称降低的保守性分析结果,表明数据质量更为可靠...
2. qPCR的产物长度一般不要太长,80-150bp就可以,因为在ChIP实验中染色质被片段化,你的PCR扩增的片段越长,这段DNA被打断的可能性就越大,丢失的信息也就越多。 3. 在使用珍贵的ChIP样品前,先用genomic DNA做个qPCR来检验引物的效率和特异性吧。
引物设计Tips 1. TF结合的区域通常是启动子,UTR这些A/T比例比较高的区域,因而如果设计出来的引物Tm值略低,也是正常的,只要可以保证引物的特异性,不必强求退火温度比Tm低5度。 2. qPCR的产物长度一般不要太长,80-150bp就可以,因为在ChIP实验中染色质被片段化,你的PCR扩增的片段越长,这段DNA被打断的可能性就...
6.对于长片段或长DNA片段的区域,如果设计上没有合适的PCR产物插入目标区域,可以考虑设计探针以便于后续直接捕获分析。 7.在进行基因芯片设计时,要考虑设计的通用性,以便于不同生物基因组或不同组织样本的后续分析。 总的来说,Chip引物设计是一个精细平衡的过程,需要考虑到许多因素,包括但不限于引物的长度、温度、...
•如有必要,实验者可以合成Human的GAPDH基因的PCR引物对作为目的蛋白抗体免疫沉淀后PCR的阳性对照引物对,这一步可选做。 引物序列如下: 5'-TACTAGCGGTTTTACGGGCG-3' 5'-TCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA-3' 但有一点需要注意,有些靶蛋白的ChIP实验是不适合采用GAPDH的基因来作为靶蛋白抗体的阳性引物对照的,因为异染色...
Chip引物的熔解温度(Tm值)应该在55-65℃之间。Tm值过低可能导致非特异性结合,而Tm值过高则可能导致引物在富集过程中难以与目标DNA结合。 4. 引物特异性 Chip引物必须具有高度的特异性,以确保只捕获与目标蛋白质结合的DNA片段。为了验证引物的特异性,可以使用基因组DNA进行体外PCR扩增,并通过电泳检查扩增产物的大小和...