通过BLAST验证,确保设计的引物具有高度的特异性,不会扩增出其他非目标DNA区域。这是ChIP实验成功的关键之一。 ▲PCR验证: 在含有目标DNA的模板和不含目标DNA的负对照样本上进行PCR验证,进一步确认引物的特异性。 ▲ChIP-qPCR结果分析: ●标准曲线的建立: 通过稀释不同比例的Input样本建立qPCR标准曲...
引物的退火温度应相近,以确保PCR反应的均匀性。 ㈢GC含量: GC含量约为50%时,引物的特异性通常较好。 ㈣避免非特异性扩增: 可以使用Primer-Blast等软件来验证引物的特异性,避免非特异性扩增。 ㈤产物长度:CHIP实验的产物长度一般不超过150bp,以适应染色质被片段化的特点。较长的产物可能增加DNA被打断的...
一、常规PCR PCR是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术,其中引物的好坏与PCR结果有密切关系。PCR不仅要求引物与靶DNA特异结合,还要求DNA聚合酶能对引物进行有效的延伸(图1)。 图1 PCR实验原理 ◆ 引物设计要遵循以下原则 ◆ 01.引物长度一般在15-30bp; 02.引物GC含量一般为40%-60%; 03.引物所对...
引物设计Tips 1. TF结合的区域通常是启动子,UTR这些A/T比例比较高的区域,因而如果设计出来的引物Tm值略低,也是正常的,只要可以保证引物的特异性,不必强求退火温度比Tm低5度。 2. qPCR的产物长度一般不要太长,80-150bp就可以,因为在ChIP实验中染色质被片段化,你的PCR扩增的片段越长,这段DNA被打断的可能性就...
二、ChIP-qPCR引物设计: 接上,放大之后华友6000多长,而且peak看的更清楚了: 继续放大,只有250bp。嗯,刚好,因为我们做chip-qpcr验证的时候,设计引物扩增出来的片段最好是在100-150就行。 所以我接着就要拿这一段250bp的序列去设计引物。如下获取dna序列...
如图,这个 ChIP-Seq 的数据的各个质控参数都还可以,PBC>82%,表明建库过程中没有 PCR bias。用 Phastcon 检测 ChIP-Seq 数据中结合位点的保守性,因为 TF 的 DNA 结合序列在物种间相对保守,这种中间峰值最高,两边对称降低的保守性分析结果,表明数据质量更为可靠...
引物设计Tips 1. TF结合的区域通常是启动子,UTR这些A/T比例比较高的区域,因而如果设计出来的引物Tm值略低,也是正常的,只要可以保证引物的特异性,不必强求退火温度比Tm低5度。 2. qPCR的产物长度一般不要太长,80-150bp就可以,因为在ChIP实验中染色质被片段化,你的PCR扩增的片段越长,这段DNA被打断的可能性就...
1. TF结合的区域通常是启动子,UTR这些A/T比例比较高的区域,因而如果设计出来的引物Tm值略低,也是正常的,只要可以保证引物的特异性,不必强求退火温度比Tm低5度。 2. qPCR的产物长度一般不要太长,80-150bp就可以,因为在ChIP实验中染色质被片段化,你的PCR扩增的片段越长,这段DNA被打断的可能性就越大,丢失的...
6.对于长片段或长DNA片段的区域,如果设计上没有合适的PCR产物插入目标区域,可以考虑设计探针以便于后续直接捕获分析。 7.在进行基因芯片设计时,要考虑设计的通用性,以便于不同生物基因组或不同组织样本的后续分析。 总的来说,Chip引物设计是一个精细平衡的过程,需要考虑到许多因素,包括但不限于引物的长度、温度、...
这时,如果一定要做阳性对照,还可以采用另一个方案,使用阳性抗体histone H3抗体配合靶基因的特异性引物来做PCR,因为任何靶基因都有组蛋白的结合,所以histone H3抗体免疫沉淀下来的DNA用靶基因引物做PCR也肯定会产生阳性信号。 使用者针对目的DNA 设计适宜的特异性引物至关重要。