选择在三组数据中都有 peak 的区域,Zoom In。在有 peak 富集的区域选择 DNA 序列用来设计阳性对照的引物。对于你感兴趣的结合位点,可以先定位到基因,再根据 ChIP-Seq 的数据选择有 peak 富集的区域。 获取DNA 序列 获得DNA 序列了,就可以进一步利用 Primer 5 ...
2、引物设计原则跟普通的引物相同,但是,超声后DNA被打断,所以PCR产物要尽量短一些,100 多bp就足够了,因为产物长度越长,这段DNA被打断的可能性就越大,P出来的可能性就越小
引物设计之后之后,我们还要用引物blast一下,看是否能扩增出其他的条带,如下操作: 在这个页面,我们只要填写我们的上下游引物就行: 因为我们是做dna的定量,所以要选取基因组。同时选择人: 从上图我们知道,这个引物可以扩增出很多产物。这个不重要,因为我们...
1.首先通过UCSC获得特点位置的DNA序列 选择hg38的基因组 输入序列位置 即可获得DNA序列 2.通过DNA序列设计引物 BLAST: Basic Local Alignment Search Tool (nih.gov) 选择primer-blast 粘贴序列到PCR TEMPLATE,MAX选择250,C,G比例调节一下,其他按照正常设计引物来,get primer 利用UCSC-blast检测。选择in-silico pcr...
应当遵循以下标准设计引物: 常规PCR实验Protocol 根据待分析样品的数量,标记适宜数量的 0.2 mL PCR管。这些样品应当包括1%样品Input输入对照、阴性对照 Normal Mouse/Rabbit IgG样品,和未加入任何DNA模板的空白对照以排除PCR反应中的DNA污染。 向每管中添加2 μL相应的DNA样品。
ChIP的标志之一是通过qPCR定量纯化的DNA产物的能力。需要以解交联和纯化后2%的Input DNA(不稀释)、目的蛋白抗体IP后的DNA、IgG抗体IP后的DNA分别作为模板(各取未稀释的DNA 2ul),分别加入所要检测的目的基因对应的ChIP引物,进行定量PCR反应,并获得各自的Ct值。按照下面公式计算ChIP富集效率: ...
为了确保得到可以信任的ChIP结果,进行适当的QC非常重要。最好的方法是免疫共沉淀反应后进行qPCR检测。使用目标蛋白已知的结合区域和非结合区域设计引物作为阳性和阴性对照进行检测。 详细检测方法可参考文末《往期精彩内容》文章“如何判断ChIP实验是否成功?”及“手把手教您设计ChIP-qPCR引物”。
引物设计完成之后，还需要对引物的特异性进行验证，例如oligo7、Primer-Blast、PCR产物琼脂糖凝胶电泳等，...
3)阳性对照:一般用anti-RNA Polymerase II抗体,因为RNA Polymerase II是通用转录因子,在所有细胞中都能结合基因(当然是在该细胞中表达的基因,所以为了保证阳性对照有效,一般选择阳性对照的引物是根据管家基因设计的)的核心启动子区,因此,理论上ChIP后PCR都会有条带,也用于判断ChIP的效率。
3)阳性对照:一般用anti-RNA Polymerase II抗体,因为RNA Polymerase II是通用转录因子,在所有细胞中都能结合基因(当然是在该细胞中表达的基因,所以为了保证阳性对照有效,一般选择阳性对照的引物是根据管家基因设计的)的核心启动子区,因此,理论上ChIP后PCR都会有条带,也用于判断ChIP的效率。