F、互补序列:避开引物内部或两条引物之间有 3 个碱基以上的互补序列。 G、PCR 扩增产物长度: 80～150 bp 较为合适(可以延长至 300 bp)。 荧光定量PCR实验Protocol 标记适当数量、兼容待用 PCR 仪型号的 PCR 管或 PCR 板。PCR 反应应当包括靶蛋白抗体Anti-target IP样品、阴性对照 Normal Mouse/Rabbit IgG样品...
这时,如果一定要做阳性对照,还可以采用另一个方案,使用阳性抗体histone H3抗体配合靶基因的特异性引物来做PCR,因为任何靶基因都有组蛋白的结合,所以histone H3抗体免疫沉淀下来的DNA用靶基因引物做PCR也肯定会产生阳性信号。 特别提醒: ChIP-qPCR和普通逆转录-qPCR的引物设计有很大不同。 普通逆转录 qPCR引物设计里一...
• 如有必要,实验者可以合成Human的GAPDH基因的PCR引物对作为目的蛋白抗体免疫沉淀后PCR的阳性对照引物对,这一步可选做。 引物序列如下: 5'-TACTAGCGGTTTTACGGGCG-3' 5'-TCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA-3' 但有一点需要注意,有些靶蛋白的ChIP实验是不适合采用GAPDH的基因来作为靶蛋白抗体的阳性引物对照的,因为异染...
如图,这个ChIP-Seq的数据的各个质控参数都还可以,PBC>82%,表明建库过程中没有PCR bias。用Phastcon检测ChIP-Seq数据中结合位点的保守性,因为TF的DNA结合序列在物种间相对保守,这种中间峰值最高,两边对称降低的保守性分析结果,表明数据质量更为可靠,但组蛋白修饰并不一定遵循这一规律。 可以同时选几个ChIP-Seq 数据...
如图,这个ChIP-Seq的数据的各个质控参数都还可以,PBC>82%,表明建库过程中没有PCR bias。用Phastcon检测ChIP-Seq数据中结合位点的保守性,因为TF的DNA结合序列在物种间相对保守,这种中间峰值最高,两边对称降低的保守性分析结果,表明数据质量更为可靠,但组蛋白修饰并不一定遵循这一规律。
二、ChIP-qPCR引物设计: 接上,放大之后华友6000多长,而且peak看的更清楚了: 继续放大,只有250bp。嗯,刚好,因为我们做chip-qpcr验证的时候,设计引物扩增出来的片段最好是在100-150就行。 所以我接着就要拿这一段250bp的序列去设计引物。如下获取dna序...
引物设计Tips 1. TF结合的区域通常是启动子,UTR这些A/T比例比较高的区域,因而如果设计出来的引物Tm值略低,也是正常的,只要可以保证引物的特异性,不必强求退火温度比Tm低5度。 2. qPCR的产物长度一般不要太长,80-150bp就可以,因为在ChIP实验中染色质被片段化,你的PCR扩增的片段越长,这段DNA被打断的可能性就...
如图,这个 ChIP-Seq 的数据的各个质控参数都还可以,PBC>82%,表明建库过程中没有 PCR bias。用 Phastcon 检测 ChIP-Seq 数据中结合位点的保守性,因为 TF 的 DNA 结合序列在物种间相对保守,这种中间峰值最高,两边对称降低的保守性分析结果,表明数据质量更为可靠...
1.首先通过UCSC获得特点位置的DNA序列 选择hg38的基因组 输入序列位置 即可获得DNA序列 2.通过DNA序列设计引物 BLAST: Basic Local Alignment Search Tool (nih.gov) 选择primer-blast 粘贴序列到PCR TEMPLATE,MAX选择250,C,G比例调节一下,其他按照正常设计引物来,get primer ...
2、PCR的阴性引物对照：选做 考虑目的蛋白抗体与DNA的非特异性结合的可能，所以通常还会选择数对阴性引物，即目的蛋白肯定不会结合的DNA序列，作为该抗体的阴性对照。3、PCR的阳性引物对照：选做 4、Spike-in参照：选做 什么是ChIP spike-in？ChIP Spike-in指的是在一个ChIP实验中，在纯化富集得到的目的DNA片段...