想拿到条带清晰、背景干净的可靠WB结果,WB最后的检测步骤至关重要。化学发光法是市场占用率最广泛的高灵敏度检测方法。ECL发光液:指一种具有较高的化学发光强度的试剂。 一般使用的发光液A和B,在辣根过氧化物酶(HRP)的催化作用下,A液和B液反应生成一种过氧化物,过氧化物不稳定随即分解,形成一种能发光的电子激...
2、夹起膜放入玻璃皿中,吸显影液滴在膜上,确保显影液浸润到了膜所有地方; 3、image Lab曝光步骤:膜放置皿中(小口径玻璃皿中)—打开仪器(image lab),膜放入机器—选择印迹—colorimetic—自动曝光—拍白光圈 4、曝光拍照(CHEMI)—选择“放置凝胶”——设置曝光时间(自动or手动)—凝胶成像—保存 注意:一抗原液(...
05、免疫杂交及检测 Western Blot的最后一步为免疫杂交及检测,当蛋白质转印到PVDF膜后,依次使用一抗、二抗进行免疫杂交,然后使用化学发光进行条带的成像,得到最终的实验结果。 由于PVDF膜对蛋白具有很强的亲和力,未转印上蛋白质的区域在后续的抗体孵育过程中可能会吸附抗体,造成检测时背景高甚至出现非目标条带的情况,...
蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)是将蛋白质经电泳分离后转移到膜上,然后利用抗体进行检测的技术。完整的WB流程,如下图所示,包含样本制备、SDS-PAGE、转膜、抗体结合、蛋白检测等5个大步骤。 样品制备 1、蛋白提取 1)融解RIPA裂解液,混匀。取适当量的裂解液,在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为1 mM。
(1)根据wb检测试剂盒说明书,配制显影液。 (2)将孵育完成的膜用镊子将其平铺在平板上,移液枪吸取发光底物,均匀覆盖膜。 (3)将平板放入显影仪。 wb检测 化学发光 wb检测 化学发光 最后就是进行整个western blot(蛋白质免疫印迹)实验结果的拍照与总结分析啦,回顾整个实验过程,详细步骤其实就是:提取细胞蛋白、BCA定...
一、WB实验的基本原理：蛋白质免疫印迹(Western Blot)是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。一个基因表达终极结果是产生相应的蛋白质(或酶)。因此检测蛋白质是测定基因表达的主要标志，检测蛋白质的方法很多，除 ELISA 法外，也可用与检测 DNA 和 RNA 相类似的吸印方法。与Southern或Northern杂交方法...
6. 蛋白质免疫检测 1) 将 PVDF 膜放入封闭液中(含 5 %脱脂牛奶的 TBST),室温封闭 2 h; 2) 将 PVDF 膜用 TBST 简单冲洗后放入用封闭液稀释的一抗中,4 ℃轻摇过夜; 3) 将 PVDF 膜从稀释过的一抗中取出,用 TBST 洗膜 3×15 min; 4) 将 PV...
蛋白质免疫印迹法,即Western Blot,基本原理涉及通过PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)对蛋白质样品进行分离,随后将其转移至固相载体,如硝酸纤维素薄膜(NC膜)或PVDF膜。固相载体以非共价键方式吸附蛋白质,同时能够保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性的不变性。 在该过程中,固相载体上的蛋白质或多肽被作为抗原,与相应的抗体发...
图 1. Western blot 的流程图[2]1.万丈高楼第一步：准备材料 要想实验节奏稳，准备工作那可要妥妥...
Western,也称Western blot、Western blotting、Western印迹,是用抗体检测蛋白的重要方法之一。检测材料或者药物对某个信号通路的影响,检测对细胞内某个特定蛋白的影响。 Western可以参考如下步骤进行操作: 1. 收集蛋白样品(Protein sample preparation) 可以使用适当的裂解液,裂解贴壁...