a、准备工作:分装需要体积的蛋白裂解液(IP/RIPA),再分别加蛋白酶抑制剂(蛋白裂解液:PMSF 体积比为100:1),磷酸化蛋白酶抑制剂(蛋白裂解液:磷酸化蛋白酶抑制剂体积比为100:2)于蛋白裂解液中,加入Aprotinin 蛋白酶抑制剂,蛋白裂解液:Aprotinin(500×)体积比为 100:0.2; b、剪取适量组织(尽量保证每一粒样品都剪...
蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)是将蛋白质经电泳分离后转移到膜上,然后利用抗体进行检测的技术。完整的WB流程,如下图所示,包含样本制备、SDS-PAGE、转膜、抗体结合、蛋白检测等5个大步骤。 样品制备 1、蛋白提取 1)融解RIPA裂解液,混匀。取适当量的裂解液,在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为1 mM。
Western Blot的最后一步为免疫杂交及检测,当蛋白质转印到PVDF膜后,依次使用一抗、二抗进行免疫杂交,然后使用化学发光进行条带的成像,得到最终的实验结果。 由于PVDF膜对蛋白具有很强的亲和力,未转印上蛋白质的区域在后续的抗体孵育过程中可能会吸附抗体,造成检测时背景高甚至出现非目标条带的情况,因此在抗体孵育前需对...
(一般是先加PBS再加标准品,试剂先加多的,再加少的,也就是先按20、19、18、16、12、8、4、0μlH2O于96孔板的标准品孔中,再各加0、1、2、4、8、12、16、20μl标准品)b.首先加19μlPBS到96孔板的样品孔中,再加入1μl 我们步骤一中提取的蛋白上清(设复孔)c.各孔加入200μl BCA工 作液,37℃放...
(1)根据wb检测试剂盒说明书,配制显影液。 (2)将孵育完成的膜用镊子将其平铺在平板上,移液枪吸取发光底物,均匀覆盖膜。 (3)将平板放入显影仪。 wb检测 化学发光 wb检测 化学发光 最后就是进行整个western blot(蛋白质免疫印迹)实验结果的拍照与总结分析啦,回顾整个实验过程,详细步骤其实就是:提取细胞蛋白、BCA定...
与Southern或Northern杂交方法类似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过电泳分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽...
WB,(Western blotting),中文名蛋白质印迹,又称免疫印迹(immunoblotting),用于检测特异性目的基因表达的蛋白成分。比如说你要用大肠或者酵母表达某种目的蛋白,把基因克隆到宿主后,要检测的目的蛋白的表达就可以用western blot。 总体来说有5个步骤,蛋白电泳,转膜,封闭,加抗体,以及检测。
Western blot法的方法包括以下步骤: 1.蛋白质电泳分离:将待检测的蛋白质样品加入聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)中进行电泳分离。SDS-PAGE可以将蛋白质按照大小分离,同时使用SDS可以使蛋白质带有负电荷,使其移动速度更加均匀。 2.转移:将蛋白质从凝胶转移到聚乙烯膜(PVDF)或硝酸纤维素膜(NC)上。转移可以使用湿法或半湿法...
6. 蛋白质免疫检测 1) 将 PVDF 膜放入封闭液中(含 5 %脱脂牛奶的 TBST),室温封闭 2 h; 2) 将 PVDF 膜用 TBST 简单冲洗后放入用封闭液稀释的一抗中,4 ℃轻摇过夜; 3) 将 PVDF 膜从稀释过的一抗中取出,用 TBST 洗膜 3×15 min; 4) 将 PV...
WB,是Western blotting的缩写,即蛋白质印迹法,又称免疫印迹(immunoblotting),也就通过电泳技术分离不同组分,再采用印迹技术将蛋白质转移(“印”)到特定的膜上,再利用抗原-抗体的特异性结合原理,用抗体作为探针去实现检测复杂样品中的靶标蛋白的方法,这项技术也可以用来检测不同时期蛋白表达的水平以及蛋白相互作用等...