没有条带首先利用丽春红对膜染色,若有条带在,就说明是转膜后面的封闭一抗二抗操作有问题,我们可通过调节后面的实验条件,重新对膜进行处理,最后还是没出不排除一抗有问题;若丽春红染色没有条带,则可以放弃此膜,转膜前面的步骤哪里出错,有可能蛋白浓度低或蛋白未提出。
根据蛋白上样量确定体积（如上样总体积16ul (加 混匀的4x Laemmli+β-巯基乙醇 煮沸变性)，上样量20ug，测得蛋白浓度5ug/ul，则取蛋白提取液体积 volume = 20/5 = 4ul），补PBS 8ul，再加4x Laemmli 4ul, 使上样体积相等。一般99℃水浴变性5min（变性可尝试不同时间，如3min、7min或更长），保存于...
Western Blot验证蛋白表达情况 一.Western Blot实验原理 利用SDS-PAGE技术对蛋白质多肽样品直接进行电泳分离,转移多肽/蛋白吸附到固相载体表面材料(如硝酸纤维素薄膜)上(以非共价键形式),并保持电泳分离的多肽/蛋白的类型及其生物学活性不变。以固相载体上所附着的固定的蛋白质/多肽分子片段作为载体抗原,与对应的抗体起...
蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)是将蛋白质经电泳分离后转移到膜上,然后利用抗体进行检测的技术。完整的WB流程,如下图所示,包含样本制备、SDS-PAGE、转膜、抗体结合、蛋白检测等5个大步骤。 样品制备 1、蛋白提取 1)融解RIPA裂解液,混匀。取适当量的裂解液,在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为1 mM。
一、WB实验的基本原理：蛋白质免疫印迹(Western Blot)是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。一个基因表达终极结果是产生相应的蛋白质(或酶)。因此检测蛋白质是测定基因表达的主要标志，检测蛋白质的方法很多，除 ELISA 法外，也可用与检测 DNA 和 RNA 相类似的吸印方法。与Southern或Northern杂交方法...
一个基因表达的终极结果是产生相应的蛋白质(或酶),因此检测蛋白质是测定基因表达的主要标志。与Southern或Northern杂交方法类似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过电泳分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键...
1.提蛋白: 蛋白裂解液配方: RIPA:1ml PMSF:10μl Cocktail:20μl RIPA裂解液(RIPA Lysis Buffer)是一种传统的细胞组织快速裂解液。RIPA裂解液裂解得到的蛋白样品可以用于常规的PAGE、Western、免疫沉淀(immunol precipitation,IP)、免疫共沉淀(co-IP)和ELISA等。
蛋白免疫印迹（Western Blot）Buffer的准备 1）准备甲醇和ddH2O；2）配制1× PBST：500 mL 1× PBS+0.25 mL tween 20；3）配制5%的BSA封闭液：2.5 g的BSA溶解到50 mL 1x PBST中；4）配制一抗，二抗：用5%的BSA封闭液按说明书推荐比例稀释(一般新买的培养基可以进一步稀释使用)；5）10× running buffer...
(1)根据wb检测试剂盒说明书,配制显影液。 (2)将孵育完成的膜用镊子将其平铺在平板上,移液枪吸取发光底物,均匀覆盖膜。 (3)将平板放入显影仪。 wb检测 化学发光 wb检测 化学发光 最后就是进行整个western blot(蛋白质免疫印迹)实验结果的拍照与总结分析啦,回顾整个实验过程,详细步骤其实就是:提取细胞蛋白、BCA定...