首先,提取正常小鼠和肝癌小鼠模型的肝脏总 RNA,检测其浓度后进行反转录获得 cDNA。然后以 cDNA 为模板,通过 PCR 反应扩增获得大量的 p53 基因。🔍 引物设计 使用Oligo 软件设计 p53 引物。首先登陆 NCBI,输入 p53 的登陆号 M13874,获得其 CDS 等详细信息。复制序列,保存为.seq 格式。打开 Oligo 软件,打开刚保...
一、常规PCR PCR是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术,其中引物的好坏与PCR结果有密切关系。PCR不仅要求引物与靶DNA特异结合,还要求DNA聚合酶能对引物进行有效的延伸(图1)。 图1 PCR实验原理 ◆ 引物设计要遵循以下原则 ◆ 01.引物长度一般在15-30bp; 02.引物GC含量一般为40%-60%; 03.引物所对...
1. 上下游引物要保守:扩增子长度需选择一段保守片段(100-200 bp)进行PCR扩增,选择片段需跨越内含子,因内含子的基因组DNA序列不会被扩增,也可减少从污染的基因组DNA中扩增得到的假阳性风险。引物选取同样需要保守。 2. 引物长度和Tm值:引物设计长度为18-25 bp,Tm值...
在整个荧光定量 PCR 实验设计中,引物的设计是实验成功的关键因素,很大程度决定了检测的灵敏度和准确性,一般 real-time PCR 引物的设计应遵循如下原则:1. 引物应在核酸系列保守区内设计并具有特异性。 2. 扩增产物长度在 80-150bp。最长不要超过 300bp。 3. 产物不能形成
选择PCR模板区; 输入FASTA格式的序列或Accession Number,或者点击“选择文件”载入; 可设置正向引物和反向引物的起始和终止位置; 选择引物参数区; 若你自己设计好了引物,可在此输入引物验证引物好坏; 可输入PCR产物的大小和Tm值参数。 内含子/外显子选择区:框内可选择引物设计是否跨越内含子。
RT-qPCR 全称 Real-time polymerase chain reaction, 即实时聚合酶链锁反应,是一种在DNA扩增反应中,以萤光染色剂检测每次聚合酶链锁反应(PCR)循环后产物总量的方法。 OK～这里对RT-qPCR的原理,应用及数据分析就不再赘述了,因为今天我们主要讲的是如何设计...
8. RT-qPCR 引物设计及验证是如何做好实验之PCR实验操作的第8集视频,该合集共计16集,视频收藏或关注UP主,及时了解更多相关视频内容。
如果用于区别同源性高的序列，以及进行SNP分型解析等多重PCR检测，那么就只能用荧光探针法。而进行除此之外的RT-qPCR实验，都可以使用荧光染料法。表1.DNA结合染料法和TaqMan探针法对比 二、实验步骤 图5.RT-qPCR实验步骤示意图，图片来源：bing.com 1.设计引物 RT-qPCR的第一步是对靶基因设计特异性的引物，引物...
1.上下游引物要保守: 为了能够扩增出所需要的保守片段,必须对保守的100-200片段进行pcr扩增。所以引物的选取也要非常的保守,最好不要有不同的碱基,若不得不有时,也必须保证引物的3’端至少有4个碱基是完全保守才可。 在设计保守引物时,要在发表序列上分别找保守一致的区域,即在发表序列的5’端引物位置找的是...