一、常规PCR PCR是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术,其中引物的好坏与PCR结果有密切关系。PCR不仅要求引物与靶DNA特异结合,还要求DNA聚合酶能对引物进行有效的延伸(图1)。 图1 PCR实验原理 ◆ 引物设计要遵循以下原则 ◆ 01.引物长度一般在15-30bp; 02.引物GC含量一般为40%-60%; 03.引物所对...
首先,提取正常小鼠和肝癌小鼠模型的肝脏总 RNA,检测其浓度后进行反转录获得 cDNA。然后以 cDNA 为模板,通过 PCR 反应扩增获得大量的 p53 基因。🔍 引物设计 使用Oligo 软件设计 p53 引物。首先登陆 NCBI,输入 p53 的登陆号 M13874,获得其 CDS 等详细信息。复制序列,保存为.seq 格式。打开 Oligo 软件,打开刚保...
根据引物设计原则选择最佳引物序列,示例中的最佳引物序列为Primer pair 3,把引物复制下来即可。 二、用PrimerBank在线设计qPCR(实时定量PCR)引物,太简单了! PrimerBank是哈佛大学建立的PCR引物的公共资源,这些引物设计被用于基因表达检测或实时定量PCR(qPCR)。PrimerBank包含超过306800个引物,覆盖了大多数已知的人类和小鼠...
Analyze中第二项为Duplex Formation,即二聚体形成分析,可以选择上游引物或下游引物,分析上游引物间二聚体形成情况和下游引物间的二聚体情况,还可以选择Upper/Lower,即上下游引物之间的二聚体形成情况。引物二聚体是影响PCR反应异常的重要因素,因此应该避免设计的引物存在二聚体,至少也要使设计的引物形成的二聚体是不...
RT-qPCR 全称 Real-time polymerase chain reaction, 即实时聚合酶链锁反应,是一种在DNA扩增反应中,以萤光染色剂检测每次聚合酶链锁反应(PCR)循环后产物总量的方法。 OK～这里对RT-qPCR的原理,应用及数据分析就不再赘述了,因为今天我们主要讲的是如何设计...
RT-PCR引物的选择 逆转录引物一般包含3种:oligo dT引物,随机引物和特异性引物。对于短的且不具备发卡结构的真核细胞mRNA,三种都可用。 RT-PCR引物设计原则 1. 上下游引物要保守:扩增子长度需选择一段保守片段(100-200 bp)进行PCR扩增,选择片段需跨越内含子,因内含子...
引物设计是很重要的一环,要进行Q-PCR时,获得引物的途径有很多种,其中最为方便的是使用NCBI和primer bank,首先介绍这一方法:比如你要检测某药物对小鼠细胞中IL-2的表达影响,通过Q-PCR检测,要设计引物。 ①登陆NCBI,选择gene,在选框中输入 IL-2 mus(搜索小鼠 IL-2基因)点击搜索 获得结果如下: 选择第一个...
1.上下游引物要保守: 为了能够扩增出所需要的保守片段,必须对保守的100-200片段进行pcr扩增。所以引物的选取也要非常的保守,最好不要有不同的碱基,若不得不有时,也必须保证引物的3’端至少有4个碱基是完全保守才可。 在设计保守引物时,要在发表序列上分别找保守一致的区域,即在发表序列的5’端引物位置找的是...
不同的实验条件可能需要不同的引物设计。就像不同的天气要穿不同的衣服一样,得灵活应变。 设计好了引物,还得去验证一下,看看效果咋样。这就跟新做了一件衣服,得试试合不合身呀。要是不合适,就得赶紧调整。 总之,RT-PCR引物设计可不是件容易的事儿,得用心、细心、耐心。这就像是一场战斗,咱得做好充分的...
RT-PCR引物设计及注意事项 第四讲RT-PCR引物设计及注意事项 D 1 一、步骤1.查找目的基因序列 D 2 D 3 D 4 D 5 D 6 D 7 D 8 目的序列的选择 D 9 TNFalpha用全称 D 10 小鼠的TNFalpha序列 D