一、polyA 富集 由于真核生物成熟 mRNA 会在尾部加上一个 polyA 尾巴,可用于富集 mRNA。但是原核生物没有该特性,因此不能采用该方法,另外,有一部分 lncRNA 也具有polyA 尾巴,因此该方法也可以捕获部分包含 polyA 尾巴的 lncRNA。 目前大多数发表的 RNA-seq 数据都是基于 oligo-dT 方法富集包含 poly(A)尾巴的...
首先通过olig dT磁珠捕获获得含有polyA尾巴的RNA,接着使用olig dT+一段固定序列的引物逆转录合成cDNA第一链,然后把TSO序列通过链置换方式添加到cDNA 3’末端,使用引物PCR扩增形成双链cDNA,最后将双链cDNA末端进行修平和连接ONT测序接头形成测序文库。 图1:NGS全转录组 poly(A) 尾测序方法 技术优势 发现新的转录本...
全长转录组(Iso-Seq)是指利用三代单分子实时测序技术(SMRT),无需对RNA 进行打断和拼接,即可直接获得完整的全长转录本。由于该方法可以获得全长转录本,因此与二代短序列测序技术的 RNA-seq 对比,侧重于转录本结构的分析,能够准确识别转录本同源异构体(isoform)、可变剪切、可变polyA、融合基因、等位基因等,因此在...
因此,如果我们使用一段 带有能与A配对的T的磁珠就可以与对应的带有polyA尾巴的RNA结合,随后再经过随机打断,反转录,加adapter就可以完成建库,这样的建库策略叫做polyA + 或者 polyA positive。核心是对带有polyA尾巴的RNA进行富集。 2.2 rRNA -建库策略 那么polyA positive策略有个比较大的问题就是,会丢掉很多不带有p...
Nanopolish-polya工具可以分析纳米孔测序得到的数据,计算基因间或转录本间的poly(A)尾的长度。结果表明内含子保留的转录本相比于完全剪切的转录本具有稍长的PolyA尾巴。虽然dRNA-seq还处于起步阶段,但是其能直接检测RNA碱基修饰的潜力有望在表观转录组领域促进更新的发现。 长读长测序与短读长测序技术的比较 虽然长读...
二、转录组测序的主要步骤 RNA提取：从样本（如细胞、组织、血液等）中提取总RNA。常用的RNA提取方法包括TRIzol试剂法、柱式提取法等，需保证RNA的高质量（无降解，完整性好）。mRNA富集或rRNA去除：对于真核生物，通常通过多聚A（polyA）富集策略分离mRNA（大多数真核生物mRNA有polyA尾）。另一种方法是去除rRNA（...
说明: 这篇文章对比了多重RNA测序文库和RNA芯片的饱和度问题。其中mRNA-seq是polyA富集法,Ribo-Zero是核糖体去除法,DSN-Seq是双链特异性核酸酶处理法,FFPE是石蜡包埋样品。图上可以看出,约1350万read的mRNA-seq就能达到芯片的检测量。石蜡样品要求测序量要多一些才能达到饱和。
(1)样本制备、建库:总RNA ---> polyA富集mRNA ---> 打断 ---> 随机引物反转录成cDNA ---> 末端修复、加A、加接头 RNA提取:方法-使用trizol-based方法或者试剂盒方法; 富集mRNA,除去rRNA等RNA:依据为-在测mRNA过程中,首先要去除rRNA。以人为例,在抽提的总RNA中,95%的RNA是rRNA,2%的RNA是mRNA,剩下的...
Nanopolish-polya工具可以分析纳米孔测序得到的数据,计算基因间或转录本间的poly(A)尾的长度。结果表明内含子保留的转录本相比于完全剪切的转录本具有稍长的PolyA尾巴。虽然dRNA-seq还处于起步阶段,但是其能直接检测RNA碱基修饰的潜力有望在表观转录组领域促进...
因为beads上联接了接头,其中有一段是ploy (dT)序列(30)个,在细胞裂解释放的核酸中,只有mRNA带有polyA的尾巴,于是这段beads上面ploy (dT)就可以从众多的裂解产物里捕获到mRNA。这也就是Russell问我为什么Drop-seq要用3'端测序的原因了。 Maxter Mix中带有反转录试剂,当mRNA被捕获后,就可以从它的3‘端开始作为...