1. 测序方法 两种建库方法对应两种测序方法: 非链特异性测序方法(non-stranded RNA-seq protocol):得到的reads没有方向性,无法判断reads是属于Gene A还是属于Gene B (Antisense RNA)的。 链特异性测序方法(stranded RNA-seq protocol):得到的reads具有方向,可以根据reads方向判断reads是属于Gene A还是属于Gene B。
在RNA-Seq建库的时候,第一步都是进行RNA到cDNA的反转录,在反转录以后,普通的RNA-Seq就直接使用random primer进行第2条链合成,随后加adapter。这样构建出来的RNA-Seq库进行测序以后是分不清这个序列是来自于genome的那条链的,因为被测序的有可能是gene的foward strand 也有可能是reverse strand。 而链特异性的RNA-S...
对于微量RNA链特异性转录组文库构建，通常使用SMART技术，通过随机或oligodT引物（带一段接头序列），合成cDNA第一链，并在3'端加上三个C，进一步使用TSO( template-switching oligo )引物通过链置换添加另一端接头序列，保留了RNA的链来源信息。各种链特异性文库测序结果对比 研究者使用酿酒酵母转录组作为基准，比较...
通过权衡每种方法的性能和简易性,研究者认为dUTP二链标记方法最好,在单端和双端测序数据中Unique比例,5’和3‘端的转录本分布比例以及样本间重复性方面均比其它方法表现优异。 ABclonal 的RNA-seq链特异性文库构建试剂盒也是采用dUTP二链标记方法,确定转录本来源于正义链或反义链,更准确定量基因表达和可变剪切事件,...
链特异性总RNA-Seq是RNA-Seq中的重要应用,通过链特异性测序可以区分重叠基因边界,进行全面基因注释和定量长非编码RNAs。传统的总RNA-Seq文库制备方案通常需要100 ng-1 ug较高的RNA起始量,并且在cDNA合成和文库制备之前需要从总RNA中去除rRNA。对于挑战性样品,如激光显微切割样品RNA,很难获得10 ng起始样品,并且rRNA...
1.首先把RNA逆转录成 cDNA, 图中的RT指的是reverse transcript 即反转录酶 2.制备完的文库,是双链cDNA, 在cDNA的两端,会加上两个对称的Y型接头,这种情况下,测得结果,我们无法确定是来自正链还是反链。 中间的图 中间这幅图多展示的是用dUTP做链特异性文库: ...
那么转录出来的RNA序列是 AUGAUCACU 因为是以基因所在链的互补链为模板进行转录 image.png 然后用这个mRNA序列去制作cDNA image.png 然后用这个cDNA第一链 加dUTP去制作第二链 用双链的cDNA去制作文库 然后再把带u碱基的第二链降解 用第一个链去测序 ...
第二个read 的序列信息就是 ATGATC 所以将这两个reads比对到参考基因组 第一个read是反向匹配 reverse 第二个reads是正向匹配 forward 所以链特异性的文库类型是 rf 各个软件的参数设置 可以参考 https://rnabio.org/module-09-appendix/0009/12/01/StrandSettings/...
确定RNA-seq链特异性 查看原文 敏感性与特异性、查准率和查全率 敏感性与特异性一级目录 一级目录 感性和特异性虽然与查准率和查全率相似,但并不相同。其定义如下:在癌症示例中,敏感性和特异性指: 敏感性:在患有癌症的所有人中,诊断正确的人有多少?特异性:在未患癌症的所有人中,诊断正确的人有多少? 查准率和...
深入了解单细胞链特异性RNA-seq分析的更多内容 随着NGS技术的不断发展,单细胞转录组测序也逐渐成为大家尤为关注的研究。单细胞测序的技术不断涌现,也有多种方法可以选择。 但是,重要的技术革新总是由“如果”开始。比如,如果样本是单细胞,如果还想同时分析编码和非编码RNA,如果还想知道链来源信息……这么多如果想要...