转录组测序分析(RNA-seq)通过提取所要研究的mRNA,将其反转录成cDNA文库,在DNA小片段两端加上接头,利用高通量测序技术统计相关小片段数计算出不同mRNA的表达量,精确地识别可变剪切位点及编码序列单核苷酸多态性,获得某一物种特定组织或器官在某一状态下几乎所有转录本的序列信息[2].目前RNAseq已广泛应用于基础研究、...
RNA-seq全流程和细节探讨 1. 技术流程概括: RNA-seq技术流程可概括如下图,主要包括建库、扩增和测序三大板块。 原创 2. 接头序列(Adapter)的功能: (1)在cDNA文库构建板块中Adapter的功能是充当文库PCR扩增的引物,这次PCR扩增的目的是使DNA样品浓度满足测序仪上样要求。 (2)在测序板块中Adapter的功能是充当序列桥...
可以通过创建strand library来保存有关片段源自哪条链的信息。最常用的方法是在第二条cDNA链的合成过程中加入deoxy-UTP。一旦生成双链cDNA片段,序列接头就会连接到末端。(也可以在此步后进行片段大小选择) 2.4. PCR扩增 如果起始材料的量很低或要将cDNA分子的数量增加到足以进行测序的量,通常会对文库进行PCR扩增。...
这种情况在短读长RNA-seq中也会导致可控的3ʹ端偏好,但对定位于应用长读长的RNA-seq分析全长转录组的研究者来说,即使是低水平的RNA降解,效果也会受限。因此,相关研究者需要在RNA提取后进行严格质控。其次,中位读长长度也会受到文库制备中的技术问题与技术偏好的限制,例如cDNA合成过程中的截断或降解的mRNA反转录...
图3 整合ATAC-seq和RNA-seq的基因组可视化图谱显示受1-MCP影响的基因表达差异以及这些基因关联的染色质的可及性变化(Cai et al., 2022)。红色和蓝色表示基因的表达差异,绿色和紫色表示基因关联的染色质可及性变化。 1.3 酵母单杂筛库 酵母单杂交是将DNA顺式作用元件作为诱饵,筛选靶元件特异结合的转录因子(cDNA)...
构建RNAseq文库的过程取决于所使用的平台。然而,一般来说,所有这些文库都是通过以下步骤获得的。 RNAseq文库准备的成功依赖于每个阶段的精心控制,本文介绍创建RNAseq文库的前两个阶段(步骤1- 3)。 1)RNA分离 2)RNA片段化 3)反转录 4) cDNA高通量(下一代)测序 ...
图一:short-read,long-read和direct RNA-seq技术和工作流程 图一:A 3种RNA测序方式的建库方法概览:short-read测序(黑色),long-read cDNA测序(绿色)和long-read direct RNA-seq(蓝色)。根据不同的应用目的,文库构建的复杂性和偏好性不同。short-read和long-read cDNA的建库方案在很多步骤是一样的,比如在所有建...
RNA-seq workflow 2. RNA提取与文库制备 在对RNA进行测序前,必须从细胞环境中提取和分离出RNA制备成cDNA文库。下面将介绍涉及的许多步骤,其中还包括了质量检查,以确保获取高质量的RNA。 2.1. RNA富集 一旦使用DNAse处理(去除DNA序列)后,样本就会经历mRNA的富集(polyA富集)或rRNA的去除。
RNA-seq workflow 2. RNA提取与文库制备 在对RNA进行测序前,必须从细胞环境中提取和分离出RNA制备成cDNA文库。下面将介绍涉及的许多步骤,其中还包括了质量检查,以确保获取高质量的RNA。 2.1. RNA富集 一旦使用DNAse处理(去除DNA序列)后,样本就会经历mRNA的富集(polyA富集)或rRNA的去除。
RNA-Seq测序技术步骤可归纳为3步:构建测序文库、测序、生物信息分析(图1)。 2.1构建测序文库 首先,用合适的试剂收集要分析的组织样本。在采集样本后,通过有机提取或吸附到纺丝柱的硅膜上制备总RNA。接着,总RNA被转换成cDNA片段的文库。大多数情况下总RNA需要被分离,从...