用NanoDrop方法检测mRNA的纯度,并稀释成不同的浓度。 (2)RNADot blotting Step1:取出待测RNA样本,解冻后测量RNA浓度,全程冰上操作。 Step2:将样品浓度统一,并在新的无酶管连续稀释样品并混匀,稀释梯度不固定,可自己试试最好效果。我选择的终浓度为400/200/100μg/μL。 Step3:离心后,将RNA样品95℃加热3分钟...
第一步是总RNA的提取,使用Dynabeads® mRNA Purification Kit分离出mRNA,采用NanoDrop方法检测mRNA的纯度,并稀释成不同的浓度。第二步Dot blotting,在95℃的高温下将连续稀释的mRNA变性。在变性后立即冷却,以防止mRNA的二级结构的重新形成。将2 μl的mRNA直接转移至经核酸优化的尼龙薄膜上。在特定条件下进行自动交联...
与其他方法相比,如二维薄层色谱和LC-MS/MS等,使用Dot blotting检测mRNA中m6A甲基化总体水平的方法相对简单、快速且成本较低。第一步是总RNA的提取,使用Dynabeads® mRNA Purification Kit分离出mRNA,采用NanoDrop方法检测mRNA的纯度,并稀释成不同的浓度。第二步Dot blotting,在95℃的高温下将连续稀释的mRNA变性。在...
16,用ddH2O清洗至背景大致干净即可,约30-60s 17,白光成像采集亚甲蓝染色后的图像作为负载对照。
常用的RNA m6A修饰整体水平检测技术包括高效液相色谱-质谱联用、Dot blotting及比色法。高效液相色谱-质谱联用采用串联质谱获得RNA消化后的分子和碎片离子峰,根据m6A和总A的比例计算出m6A整体的修饰程度,实现对碱基定性和定量分析,操作繁琐,对设备要求高[6]。Dot blotting是将不同稀释浓度的RNA热变性至尼龙薄膜交联,...
常用的RNA m6A修饰整体水平检测技术包括高效液相色谱-质谱联用、Dot blotting及比色法。高效液相色谱-质谱联用采用串联质谱获得RNA消化后的分子和碎片离子峰，根据m6A和总A的比例计算出m6A整体的修饰程度，实现对碱基定性和定量分析，操作繁琐，对设备要求高。Dot blotting是将不同稀释浓度的RNA热变性至尼龙薄膜交联，经...
总RNA/mRNA m6A/ac4C定量检测(Dot Blot法) 在斑点杂交中,要检测到的生物分子不是首先通过电泳分离出来的,相反,将含有被检测分子的混合物直接点在膜上,烘烤固定。然后与m6A或Ac4C抗体(Western blot)杂交后检测,步骤如下: (1)交联:在65℃下5分钟,使mRNA变性以破坏RNA中的二级结构。变性后立即在冰上冷却,以防止...
采用实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）、western blotting和免疫荧光染色法检测METTL14和FAT4在眼黑色素瘤...
北京大学王嘉东和王维斌团队建立了分离复制叉新生DNA结合RNA的技术,并结合RNA测序和Dot Blotting发现在转录活跃区域内与复制叉相关的RNA-DNA杂合体 (RF-RDs) 的普遍存在。RF-RDs在复制应激早期防止DNA2过度切割导致的复制叉崩溃和DNA断裂,清除RF-RDs会导致转录活跃区复制叉崩溃和基因突变。他们的研究提出RNA聚合酶II依...
RNA dot blot is a technique similar to northern blotting; however, RNA samples are not separated by electrophoresis. Instead, they are spotted onto a membrane. RNA sample RNase-free water TBST (1x TBS, 0.1% Tween-20) Blocking Solution ...