Western Blot 的条带黑度反映蛋白的相对量,数值则提供了量化的比较。 检查内参蛋白表达稳定性: GAPDH 和 U6 通常用作内参,确保实验中蛋白质加载量的一致性。对比 GAPDH 和 U6 的表达稳定性来判断实验的可靠性。例如,Huh7 细胞中 GAPDH 在 Par 和 LR 之...
其原理基于碱基配对原则,通过设计与目标RNA序列互补的探针,在细胞经过固定、透化处理后,让探针进入细胞并与RNA结合,通过荧光显微镜观察到的荧光信号可精确显示RNA在细胞内的分布情况。 (Mamontova V, et al. bioRxiv. 2024) 三、RNA修饰验证 1. 斑点杂交(Dot blot) 斑点杂交(Dot blot)可检测和鉴定 DNA、RNA ...
其原理同MeRIP-seq测序中MeRIP实验相同,实验基本操作也一致:对RNA进行片段化,然后将片段化后的RNA样品分为二部分:一部分用于免疫共沉淀实验(IP)后作为IP样品,另一部分不进行IP直接作为Input样品。之后再根据实验目的的不同,对两部分RNA片段进行逆转录和qPCR。MeRIP-Seq则是捕获mRNA和片段化后,通过特定修饰抗体富集含...
用紫外线将 RNA 交联到膜上:125 mJoule/cm2 at 254 nM。 【简单理解紫外交联仪的原理,在254nm波长的紫外线下核酸与蛋白质产生共价键,核酸能铆钉在硝酸纤维素膜上,因此替代紫外交联仪,使用相同254nm的紫外线消毒灯管照射30min-1h,经过本人实验验证,可以确保核酸交联到尼龙膜上】 7、在 10 mL 的 TBST(1X ...
该方法的原理是首先提取细胞内的mRNA,将其打断成50nt左右的小片段,然后与m6A抗体进行孵育,利用免疫共沉淀富集携带有m6A的RNA片段,接着构建cDNA库进行高通量测序,最后得到全转录组水平的m6A分布图。该方法实现了对m6A的高通量检测,但mRNA被打断成50nt左右的片段,限制了m6A位...
1)整体水平检测:TLC、Dot-blot和LC-MS/MS; 2)转录组范围内m6A修饰高通量检测(图1): 基于特异性抗体的测序技术(MeRIP-seq/m6A-seq、m6A-seq2、m6A-CLIP/miCLIP); 非抗体依赖的测序技术(m6A-SEAL-seq、m6A-SAC-Seq、Nanopore Direct RNA Seq、GLORI-Seq); ...
抗原抗体与受体配体结合被利用做蛋白质。此原理是受体抗原抗体和受体配体结合被利用做蛋白质的简单定量分析。被吸附在96孔板底部的抗原抗体或者受体配体可以被标记的抗体识别，并进行定量计数形成定量分析的基础。由于培养细胞需要不断监测，所以工作量很大。快速简洁的定量分析是监测细胞表达水平监测的重要手段。
(二)点杂交或狭缝杂交(dot and slot blot)(1)将NC膜在水中润湿后,置20xSSC中浸泡1h,同时用0.1mol/L NaOH 清洗加样器,然后用高压灭菌水洗净。(2)将两张预先用20xSSC湿润的滤纸铺在抽滤加样器的下半部分的上面,将浸泡的NC膜贴在加样器上半部分的底部,NC膜的光面朝向加样孔的进口。小心排除气泡,安装好...
(2)Dot blot 该方法通过使用特定抗体来检测并定量RNA中的修饰水平。具体而言,分离的RNA直接滞留在PVDF或硝酸纤维素膜上,无需电泳分离。用于靶点修饰的特异性抗体与膜一起孵育,然后二抗杂交并随后捕获信号。比较不同实验组的结果可以得到半定量的修饰水平信息。由于工作流程简单且成本低廉,该方法已广泛应用于各种RNA种类...
但在具体工作中需要注意的是,使用时一定要根据自己的实验需要购买专用提取试剂盒,如果不是专用试剂盒,或许能提出RNA,但不能确保其质量以及完整性,会影响RT-PCR、Northern blot、Dot blot、Real time RT PCR、芯片分析、polyA 筛选、体外翻译、RNase 保护分析、分子克隆等后续实验的结果。