该技术主要利用m6A会阻碍DNA聚合酶的延伸活性和连接酶的连接效率的特点进行检测。 在m6A修饰位点上下游设计两个DNA探针:Up Probe和Down Probe(探针两端均带有固定序列,可成为最后的qPCR引物),探针与RNA退火杂交(m6A修饰位点形成gap); 用Bst DNA polymerase和dTTP(或dNTP)进行延伸反应(若该位点存在m6A修饰,则延伸效率...
m6A甲基化组学&转录组学关联分析:Meta genes整体关联、DMG-DEG对应关联、m6A修饰目标基因的筛选策略; 进一步验证或后期试验。 五、甲基化RNA免疫共沉淀(MeRIP-seq/m6A-seq)研究项目案例 标题:Sevoflurane impairs m6A-mediated mRNA translation and leads to fine motor and cognitive deficits七氟烷麻醉破坏m6A介导的mR...
将含protein A和protein G的磁珠用IP buffer(150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7.5)洗涤,然后与5 ug m6A抗体(Millipore) 4℃孵育2h;用 IP buffer洗涤两次,再用 IP buffer将磁珠重悬,加入片段化的RNA,4℃下翻转4h;用IP buffer在4℃下洗涤磁珠3次,再用m6A竞争性洗脱液,在4℃下孵育1h。将含有洗脱m6A RNA...
将含protein A和protein G的磁珠用IP buffer(150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7.5)洗涤,然后与5 ug m6A抗体(Millipore) 4℃孵育2h;用 IP buffer洗涤两次,再用 IP buffer将磁珠重悬,加入片段化的RNA,4℃下翻转4h;用IP buffer在4℃下洗涤磁珠3次,再用m6A竞争性洗脱液,在4℃下孵育1h。将含有洗脱m6A RNA...
MeRIP-seq(m6A-seq)是在全转录组水平上鉴定m6A修饰的常用方法,有以下三种研究思路: 1. 单组学分析揭示m6A的整体信息。在这里,我们可以只通过测一个组学,进行m6A Peak特征分析以及甲基化差异和富集分析,从而探究实验处理对m6A的整体影响。 2. 多组学关联分析。可以结合转录组测序探究RNA转录调控因素对于基因表达及表型...
RNA甲基化是近年来研究基因表达调控转录后变化的重要研究领域,包括N6-甲基腺苷(m6A)在内的各种类型RNA甲基化参与人类疾病发展。MeRIP-seq作为一种新兴的在转录组范围内定量检测m6A水平的测序技术,拓展了RNA表观遗传学研究的基础和临床应用,且呈上升趋势。RNA甲基化数据分析的基本问题之一是通过对比病例和对照来鉴定差异...
一、甲基化RNA免疫共沉淀(MeRIP-seq/m6A-seq)测序技术原理 表观转录组指RNA序列不发生改变的情况下,由RNA上的化学修饰调节基因表达的现象。胞内RNA的修饰超过100种,其中大部分的表观修饰发生在tRNA及其他非编码RNA上[1],发生在mRNA上的修饰无论是从种类上还是数量上都较少。下图展示了部分发生在真核生物mRNA上...
m6A-seq的input文库相当于RNA-seq文库,可以用于分析基因表达量及鉴定差异表达基因。通过定位到基因组区域或者基因外显子区的测序序列(read)的计数来估计基因的表达水平。Read计数除了与基因的真实表达水平成正比外,还与基因的长度和测序深度成正相关。为了使不同基因、不同实验间计算的基因表达水平具有可比性,利用TPM来...
利用MeRIP-seq/m6A-seq技术鉴定全基因组范围内具有m6A修饰的区域。其原理为通过特异识别m6A修饰的抗体,对细胞内具有m6A修饰的RNA片段进行免疫共沉淀。对沉淀下来的RNA片段进行高通量测序,结合生物信息学分析,即可在全基因组范围内对m6A修饰的状况进行系统...
本研究首先鉴定了RNA碱基修饰N6-甲基腺苷(m6A)在ISG调控中的作用,通过Ribo-seq和定量质谱法结合m6A免疫沉淀测序(MeRIP-seq)分析,鉴定出包含IFITM1的ISG亚群,其翻译通过m6…