因此通常说起MeRIP-qPCR,结果不能用来体现基因表达量。 那如果在MeRIP-qPCR步骤中直接多扩增一个GAPDH基因,与目的基因Input联合在一起定量表达量是否可行?我们只能说可以参考,不过由于MeRIP实验是有片段化这一步骤的,PCR信号会弱一些,对于验证表达量的目的来说还是推...
逆转录实时定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)是一种结合了逆转录PCR和实时荧光定量PCR的技术,可以对RNA分子进行定量分析。RT-qPCR先通过反转录酶将RNA逆转录成cDNA,然后利用qPCR技术对cDNA进行定量分析。RT-qPCR技术广泛应用于RNA表达水平的研究,如基因表达分析、病毒载量检测等。 RNA的荧光定量PCR引物要求与普通qPCR相同,...
5.实验结果 qPCR检测结果(详细数据见附件excel” M6A-meRIP数据分析结果”) Merip-qPCR柱状图: meRIP-阳性质控柱状图 NC组meRIP-qPCR柱状图 Treat组meRIP-qPCR柱状图 Merip RNA 片段化图: Merip RNA 片段化图
(1)MeRIP-qPCR不需要内参来进行样本间的均一化矫正 传统的RT-qPCR中,每个样本都要做一个内参基因,如哺乳动物会选择GAPDH,而miRNA则会选择U6。那么是不是m6A-IP-qPCR就真的没内参了呢?其实也不是!实际上我们会发现整个input充当了内参基因的概念,一个基因的甲基化水平是无法直接用RIP下来的RNA在做qPCR后直接用C...
MeRIP-qPCR的目的是对定量修饰位点的表达水平,因此设计的引物不仅要针对目标基因,还要针对基因上发生修饰的位点(区域)。那修饰位点的信息怎么获得呢?一般有以下几个途径: (1)从MeRIP-seq的测序结果中筛选获得: MeRIP-seq报告结果中通常会给出发生甲基化修饰的位置坐标(如云序生物报告中会以chr1:111234-111567的形式...
第四步：蛋白A/G磁珠结合。将蛋白A/G磁珠加入IP组中，孵育1小时，随后在磁力架上吸附磁珠，除去上清液，再进行洗涤和洗脱。第五步：RNA检测与验证。收集洗脱的RNA样本，进行反转录并进行qPCR验证。总结：m6A甲基化免疫共沉淀-qPCR（meRIP-qPCR）技术是一种高效研究mRNA m6A甲基化区域的方法，通过精准的...
(Quantitative Real-time PCR, qPCR) 实时荧光定量PCR,即第二代PCR,在聚合酶链反应“变性-退火-延伸”扩增过程的“延伸”段,对荧光探针标记的靶基因荧光信号进行实时采集,通过3个参数(荧光信号-Ct值-靶基因的起始浓度)间的关系,最终确定靶基因的拷贝数或基因的表达水平。qPCR常用的方法主要有两种:TaqMan探针法和SY...
老师接着说,merip-qpcr原理就是通过一种方法,先把我们需要的基因拿出来,然后用一种特殊的探针找到它,再通过qpcr这个方法放大它。这样,我们就能知道基因里面的东西是怎样的啦!哇,听着好神奇呀,像魔法一样。然后,我就开始想,原来基因里面也有这么多好玩的秘密,真想去了解更多呢。 这一天的课,真是让我大开眼界...
定量PCR检测作为实验结果的验证步骤，包括：- 溶解Mix并混匀，配制反应液并离心确保液体分布均匀。- 采用三步法程序进行反应。- 检测结果通过qPCR获得，具体数据在附件中详细列出。实验流程结束后，我们得到了Merip-qPCR柱状图和Merip RNA片段化图，以可视化的方式展示了实验结果。
我们先进行一个简单的计算,常规的RT-qPCR1个反应(1个复孔)需要的totalRNA至少0.1-1μg左右。我们按照最小反应起始量来算的话,那么1个反应需要至少100ng的totalRNA,3个技术重复(3个复孔),总计totalRNA为300ng。 我们知道totalRNA中绝大部分为rRNA,那么只有不到5%的RNA为我们需要研究的对象。PCR反应需要引物跟...