(2)注意转录方向,输入基因转录起始位点上游2000bp区域,点击Update View,得到的序列为基因的启动子区域,后续按照普通qPCR引物设计原则设计引物即可。 五、MeRIP-qPCR RNA甲基化免疫共沉淀技术(methylated RNA immunoprecipitation,MeRIP )是利用免疫共沉淀的方法即用抗RNA甲基化抗体与被随机打断的RNA片段进行孵育,下拉得到有...
保存后进行引物的设计: (2)通过网站预测获得: 如果没有测序结果,想直接通过MeRIP-qPCR验证关注的某基因上是否存在修饰区域,就只能通过预测得到发生修饰概率高的区域位置,再针对位点设计引物,进行qPCR实验。网站的预测通常是基于研究公认的该种修饰具有的motif序列等进行预测,在网站输入目标RNA的序列后,就可生成预测结果。
这里需要注意的是,IP下来的RNA需要用随机引物进行逆转录,而第四步中设计的引物用的是特异性引物,这个大家要注意区分和甄别。 第五步,使用上一步设计好的引物,对input、m6A-IP和IgG-IP中的RNA进行qPCR反应并计算相应的CT值。 所以到这里我们的实验部分已经完成了,简单总结下就是想要做够10个左右基因的验证,必须...
在m6A修饰位点上下游设计两个DNA探针:Up Probe和Down Probe(探针两端均带有固定序列,可成为最后的qPCR引物),探针与RNA退火杂交(m6A修饰位点形成gap); 用Bst DNA polymerase和dTTP(或dNTP)进行延伸反应(若该位点存在m6A修饰,则延伸效率会降低); 用SplintR ligase(该酶可以连接与RNA片段互补的两个ssDNA)进行连接反应(...
使用m6A特异性抗体免疫沉淀RNA,然后使用TYK2特异性引物进行RT-qPCR。研究观察到在TYK2敲除细胞的再激活过程中,与sh-对照细胞相比,显著富集(图4G)。这一发现表明TYK2 mRNA在YTHDF2敲除后稳定并积累。这些结果强烈表明,YTHDF2是负责TYK2 mRNA稳定性和降解的关键调控分子。
2.执行实时荧光定量RT-PCR时使用阳性对照引物作为目标和使用阴性对照引物作为目标 时,应该分开. 3. 从qPCR设备制造商那里使用实时荧光定量检测系统来计算阈值循环(Ct). 4. 使用带抗-m6A的样本来确定浓度(C)并且使用标准曲线带有对照 mouse IgG的样本百 分比的样本来减去Ct值获得输入IP 样本的Ct值即:ΔCt = ...
RNA修饰在过去被认为是对RNA基础核酸结构的化学结构微调,比如rRNA,tRNA和snoRNA。随着科学技术的发展和相关抗体的出现,科学工作者对RNA修饰的研究越来越深入。现在的研究结论与之前的观点有很大的改变。RNA修饰在转录组水平广泛存在,并且是一种可逆的,处于动态调节状态的表观修饰。这一过程参与到生物学过程的方方面面,...
3、MeRIP-qPCR的引物如何设计? MeRIP-qPCR的目的是对定量修饰位点的表达水平,因此设计的引物不仅要针对目标基因,还要针对基因上发生修饰的位点(区域)。那修饰位点的信息怎么获得呢?一般有以下几个途径: (1)从MeRIP-seq的测序结果中筛选获得: MeRIP-seq报告结果中通常会给出发生甲基化修饰的位置坐标(如云序生物报告中...
MeRIP-qPCR引物如何设计? 由于目的是定量位点的修饰水平,因此MeRIP-qPCR的引物不仅是针对目标基因,还要是针对其上的那个修饰位点(区域)。这个位点信息可以从: (1)MeRIP-seq的测序结果中筛选得来 通常是一段位置坐标,比如云序生物提供的MeRIP-seq结果,某个甲基化峰位...
如果是测序,就是在这里把紧接的qPCR改为接建库测序。 3.MeRIP-qPCR引物如何设计? 由于目的是定量位点的修饰水平,因此MeRIP-qPCR的引物不*是针对目标基因,还要是针对其上的那个修饰位点(区域)。这个位点信息可以从: (1)MeRIP-seq的测序结果中筛选得来 通常是一段位置坐标,比如云序生物提供的MeRIP-seq结果,某个...