为了在NEAT1-1上确定真正的m6A位点,研究人员通过m6A RIP-seq数据分析发现在NEAT1变体1(NEAT1-1)上有4个高峰值,而在NEAT1变体2(NEAT1-2)的其他区域有低信号。因此,研究人员重点关注了NEAT1-1的m6A,并按照NEAT1-1的5’-3’依次将m6A位点标记为#1到#4。CLIP-PCR分析发现在前列腺癌P-18细胞中,所有四个位点...
RIP可以看成是普遍使用的染色质免疫沉淀ChIP技术的类似应用,但由于研究对象是RNA-蛋白复合物而不是DNA-蛋白复合物,RIP实验的优化条件与ChIP实验不太相同(如复合物不需要固定,RIP反应体系中的试剂和抗体绝对不能含有RNA酶,抗体需经RIP实验验证等等)。RIP实验结束后富集到的RNA,既可以直接用于qPCR,也可用于芯片和测序...
MeRIP-seq将甲基化DNA 免疫共沉淀(methylated DNA immunoprecipitation, MeDIP)技术、RNA 结合蛋白免疫共沉淀(RNA immunoprecipitation,RIP)技术和RNA 测序(RNA sequencing,RNA-seq)技术组合起来,高精度地检测全基因组(或全转录组)范围内的RNA甲基化。其原理为通过特异识别m6A修饰的抗体,对细胞内具有m6A修饰的RNA片段进行...
METTL3敲除后,靶基因Ezh2的蛋白表达受到影响。而靶基因Ezh2过表达回复实验会消除METTL3敲除对细胞增殖分化的不利影响 合理推测结合目标基因的m6A Readers是哪一种 Readers的突变/敲降/敲除/过表达实验: RT-PCR验证靶基因的mRNA水平 Western blot验证靶基因的蛋白水平 Readers的RIP-qPCR验证Readers蛋白与靶基因mRNA的结合...
(图4C)的m6A-RIP-qPCR结果证实了m6A的减少。QPCR结果表明m6A标记的多功能转录本在R-3A2AmESCs中上调(图4D)。(图4E)是绝对定量QPCR分析了EB诱导后多功能性和分化标志物的表达,结果显示未能抑制多能基因的表达,还上调了分化记物。 Fig.5甲基转移酶复合体磷酸化对小鼠胚胎干细胞转录本的影响...
此外,在YTHDF1 RIP实验中检测到circALG1的富集(图7D)。当circALG1 m6A修饰位点发生突变时,YTHDF1 RIP检测结果显示,富集的circALG1显著降低,说明circALG1与YTHDF1的结合依赖于m6A修饰(图7E)。在含有circALG1-mut3序列的萤火虫荧光素酶质粒中,由于缺少m6A修饰位点,METTL3沉默后对荧光素酶活性没有影响(图7J)。
或者可以购买几种酶的抗体进行RIP实验后,对富集到的RNA进行分析挖掘,找到几种酶有互作的RNA甚至是互作区域。接下来对特定的motif进行突变等实验进行验证。在这些实验完成后,如果能发现一种全新的机制一般容易冲击顶级期刊。 (Zhao B et al. (2017) Nature, 542 (7642): 475)...
为了探讨RMRP的调控作用,我们使用catRAPID。结果显示,在NSCLC中发挥重要作用的YBX1是RMRP的潜在结合蛋白(图5C)。RIP实验显示,抗YBX1抗体显著富集了RMRP(图5D和E)。RNA下拉实验进一步证实了RMRP和YBX1之间的相互作用(图5F)。以上结果表明YBX1...
通过RIP实验(RNA结合蛋白免疫沉淀)和m6A-seq测序分析发现m6A被高度富集在突触素(Synaptophysin)的mRNA上,同时Synaptophysin的mRNA上有YTHDF1的结合位点。早先的研究发现Synaptophysin和全麻药物的神经发育毒性紧密相关。过表达YTHDF1可以回救七氟烷引起的幼年小鼠精细运动能力和认知功能障碍以及Synaptophysin的变化。研究认为YT...
RIP检测显示了IGF2BP2和TRAF1 mRNA之间的直接相互作用(图5H)。此外,在舒尼替尼耐药细胞系中,IGF2BP2和TRAF1转录本之间的直接相互作用更强(图5I)。而调控METTL14表达后,相互作用受到显著影响(图5J,K)。抑制IGF2BP2的细胞中,TRAF1 mRNA的稳定性受损(图5L)。这些结果表明,METTL14介导的m6A修饰以IGF2BP2...