MeRIP-qPCR 是m6A-IP-qPCR 的另一种说法。所以从名称上我们就能发现,m6A-IP-qPCR基本和常规的RIP-qPCR相似。当然在讨论RIP-qPCR之前,我们先来看看常规的RT-qPCR 是如何计算相对表达量的。 关于RT-qPCR的方法学论文很多,所以这里关于实验部分就不细讲了。计算基因的绝对定量需要加入外参基因,所以暂且我们先来看看相...
MeRIP-qPCR就是MeRIP实验后进行一个qPCR。在RNA量充足的情况下,可以直接使用MeRIP后的产物分别进行逆转录和qPCR,其流程与普通qPCR相同。 3)MeRIP-qPCR为什么没有内参基因? MeRIP-qPCR不需要使用内参来进行样本间的对比,此实验主要是通过计算发生修饰的转录本(IP)占该基因总转录本(Input)的比例,来体现该位点的修饰水平。
而靶基因Ezh2过表达回复实验会消除METTL3敲除对细胞增殖分化的不利影响 合理推测结合目标基因的m6A Readers是哪一种 Readers的突变/敲降/敲除/过表达实验: RT-PCR验证靶基因的mRNA水平 Western blot验证靶基因的蛋白水平 Readers的RIP-qPCR验证Readers蛋白与靶基因mRNA的结合 关于易基因RNA m6A甲基化测序(MeRIP-seq)技...
(6)研究特定m6A Readers通过结合目标基因RNA而影响目标基因的蛋白表达 合理推测结合目标基因的m6A Readers是哪一种 Readers的突变/敲降/敲除/过表达实验: RT-PCR验证靶基因的mRNA水平 Western blot验证靶基因的蛋白水平 Readers的RIP-qPCR验证Readers蛋白与靶基因mRNA的结合 YTHDF1引入突变后,检测其假定靶基因的表达和...
Readers的突变/敲降/敲除/过表达实验: RT-PCR验证靶基因的mRNA水平 Western blot验证靶基因的蛋白水平 Readers的RIP-qPCR验证Readers蛋白与靶基因mRNA的结合 YTHDF1引入突变后,检测其假定靶基因的表达和与靶基因的结合是否受到影响 关于易基因RNA m6A甲基化测序(MeRIP-seq)技术 ...
Readers的突变/敲降/敲除/过表达实验: RT-PCR验证靶基因的mRNA水平 Western blot验证靶基因的蛋白水平 Readers的RIP-qPCR验证Readers蛋白与靶基因mRNA的结合 YTHDF1引入突变后,检测其假定靶基因的表达和与靶基因的结合是否受到影响 关于易RNA m6A甲基化测序(MeRIP-seq)技术 ...
通过m6A MeRIP-qPCR和RIP-qpcr实验验证(图6c、d),再次说明了3’UTR中的两个Stat1位点被m6 A甲基化,并与YTHDF2存在相互作用。mRNA稳定性测定显示(图6e),与Ythdf2f/f BMDMs相比,Ythdf2cKO BMDMs中Stat1 mRNA的半衰期增加。此外,作者通过双荧光素酶报告实验对2个m6A位点进行突变(图6f),结果显示野生型Ythdf2...
采用甲基化RNA免疫沉淀测序(MeRIP-seq)和RNA-seq结合的高通量测序分析方法鉴定出ALKBH5的下游靶标。通过体外和体内挽救实验(In vitro and in vivo rescue experiments)验证下游靶标对ALKBH5缺失细胞或动物的功能表型作用。此外,通过RIP-qPCR、RNA下拉和RNA稳定性分析揭示了互作的reader蛋白和调控机制。
RIP-qPCR结果证实Hspa1a mRNA能直接与METTL3蛋白结合(图4f)。MeRIP-qPCR验证了在METTL3沉默的细胞系中Hspa1a mRNA的m6A修饰水平显著降低(图4g)。随后进行RNA稳定性实验以分析METTL3介导的m6A修饰对Hspa1a表达调控作用机制。METTL3沉默后,Hspa1a mRNA的衰减速度显著快于对照组(图4h)。这些结果表明METTL3增加了Hspa1a...
然后,在人肺上皮细胞(HBE)和两株NSCLC细胞株(A549和H1299)中进行甲基化RNA免疫沉淀(Me-RIP)检测。MeRIP-qPCR检测显示,HBE细胞中RMRP的m6A甲基化水平低于NSCLC细胞(A549和H1299)(图2A)。然后我们用小干扰RNA靶向m6A甲基化酶复合物的核心成...