位点特异性m6A检测方法示意图:MeRIP-qRT-PCR、SELECT和SCARLET。 总结而言,目前已经开发出的不同层面m6A修饰检测方法主要有: 1)整体水平检测:TLC、Dot-blot和LC-MS/MS; 2)转录组范围内m6A修饰高通量检测(图1): a)基于特异性抗体的测序技术(MeRIP-seq/m6A-seq、m6A-seq2、m6A-CLIP/miCLIP); b)非抗体依赖的...
3)单基因m6A位点检测技术:MeRIP-qRT-PCR、SELECT、SCARLET(图2)。 以上方法有不同的应用场景,科研老师们可以根据自己的科研需求选择适合的检测方法。 关于易基因RNA m6A甲基化测序(MeRIP-seq)技术 易基因MeRIP-seq技术利用m6A特异性抗体富集发生m6A修饰的RNA片段(包括mRNA、lncRNA等rRNA去除所有RNA),结合高通量测序,...
线粒体膜电位检测:通过流式细胞仪收集TMRE阳性细胞的比例 qRT-PCR/Western blot检测:检测细胞内与铁死亡相关的因子的变化,例如COX-2,ACSL4,PTGS2,NOX1,GPX4和FTH1等,其中COX-2,ACSL4,PTGS2和NOX1在铁死亡细胞中表达上调;GPX4和FTH1在铁死亡细胞中表达下调。 下面我们进入正题:这次我主要给大家带来两个思路,这...
m6A是RNA上最丰富的一种修饰,平均每条转录本有1~3个m6A修饰。易基因MeRIP-seq技术利用m6A特异性抗体富集发生m6A修饰的RNA片段(包括mRNA、lncRNA等rRNA去除所有RNA),结合高通量测序,可以对RNA上的m6A修饰进行定位与定量,总RNA起始量可降低至10μg,最低仅需1μg总RNA。广泛应用于组织发育、干细胞自我更新和分化、...
后续利用MeRIP-qRT-PCR对感染24h后敲除METTL3的A549细胞进行验证(图2d,e),这些数据表明病毒的早期和晚期转录单元包含m6A,并且这种修饰是由包含METTL3的细胞writer复合物添加的。然而m6A标记的确切位置无法通过此方法评估。 图2腺病毒RNAs...
m6A甲基化RNA免疫沉淀(MeRIP)是一种检测m6A修饰状态并在全转录组范围内定位m6A RNA修饰位置的方法。riboMeRIPTM m6A Transcriptome Profiling Kit 使用MeRIP方法进行m6A RNA修饰的鉴定和转录组分析。在MeRIP实验中,将RNA片段化后,使用针对m6A的单克隆抗体进行免疫沉淀。回收RNA后可进行qRT-PCR(MeRIP-qPCR)或RNA测序(MeR...
为了确定WTAP在OA中的作用,用过表达WTAP的质粒转染软骨细胞。通过qRT-PCR和WB证实WTAP mRNA和蛋白水平升高(图2a-c)。免疫荧光检测结果也显示,软骨细胞中WTAP蛋白水平升高(图2d),WTAP过表达后m6A甲基化水平升高(图2e)。 为了评估WTAP对骨关节炎软骨细胞表型的影响,测定了ADAMTS4、ADAMTS5、MMP13、IL-6、IL-8和iN...
MeRIP-qRT-PCR已被广泛用于验证高通量测序鉴定的m6A peaks。mRNA或总RNA被片段化为100-200nt,随后用m6A抗体进行免疫沉淀,富集的RNA通过常规qRT-PCR进行定量(图2)。尽管MeRIP-qRT-PCR简单实用,但它不能提供单碱基分辨率,并且依赖于m6A抗体的特异性。 基于单碱基延伸和连接的qPCR扩增方法(SELECT)利用m6A抑制DNA聚合酶...
为了揭示ALKBH5对ZNF333表达的m6A相关调控机制,研究人员对m6A测序数据进行了MeRIP qRT-PCR验证。发现m6A特异性抗体在ALKBH5过表达时显著降低了ZNF333 mRNA的富集,而在ALKBH5敲低时显著增加了ZNF333 mRNA水平的富集。此外,研究人员发现催化失活突变型ALKBH5过表达不能在mRNA和蛋白质水平上调节ZNF333的表达。当引入全局...
MeRIP-qRT-PCR已被广泛用于验证高通量测序鉴定的m6A peaks。mRNA或总RNA被片段化为100-200nt,随后用m6A抗体进行免疫沉淀,富集的RNA通过常规qRT-PCR进行定量(图2)。尽管MeRIP-qRT-PCR简单实用,但它不能提供单碱基分辨率,并且依赖于m6A抗体的特异性。 基于单碱基延伸和连接的qPCR扩增方法(SELECT)利用m6A抑制DNA聚合酶...