总RNA/mRNA m6A/ac4C定量检测(Dot Blot法) 在斑点杂交中,要检测到的生物分子不是首先通过电泳分离出来的,相反,将含有被检测分子的混合物直接点在膜上,烘烤固定。然后与m6A或Ac4C抗体(Western blot)杂交后检测,步骤如下: (1)交联:在65℃下5分钟,使mRNA变性以破坏RNA中的二级结构。变性后立即在冰上冷却,以防止...
(1)picoMeRIP-seq 敏感的皮克级MeRIP-seq(picoMeRIP-seq)方法,适用于低RNA/细胞起始量的,也适用于单细胞MeRIP-seq,一些关键步骤得到系统地优化,包括细胞裂解的策略以及单个实验管中基因组DNA和核糖体RNA的去除;打断/破碎RNA的策略;商业化m6A抗体的选择;抗体结合后RNA的洗涤条件;定制化的测序文库构建。在单个斑马鱼合...
m 6 a 斑点杂交 简介 斑点杂交(dotblot)是一种检测,分析和鉴定 dna,rna和蛋白质的技术,通过显影斑点的有无及颜色的深浅来判断是否有杂交及其杂交强度.作为目前高等真核生物和植物中最丰富的一种 rna转录后修饰,m 6 a修饰能够调控 rna的剪接与转运,稳定性,出核和翻译成...
经过凝胶纯化和核酸酶P1消化后,通过TLC确定m6A修饰状态(图2)。SCARLET技术的应用受到其复杂步骤、长实验时间和使用放射性试剂的限制。 图2:单基因m6A位点检测方法 位点特异性m6A检测方法示意图:MeRIP-qRT-PCR、SELECT和SCARLET。 总结而言,目前已经开发出的不同层面m6A修饰检测方法主要有: 1)整体水平检测:TLC、Dot-...
斑点杂交(Dot blot)可检测和鉴定 DNA、RNA 和蛋白质,通过显影斑点的有无及颜色的深浅来判断是否有杂交及其杂交强度。在研究 RNA 修饰时经常用到斑点杂交来对细胞内总RNA的修饰水平进行定性或半定量分析。具体步骤是指将待测的 RNA 变性后点加在硝酸纤维素膜或 NC 膜上,紫外交联固定后用m6A或者m5C抗体进行杂交,...
实验材料 采用强光处理0h和4h的野生型(Col-0)和VIR突变体幼苗(vir-1),共12个样本,分别进行m6A-seq,RNA-seq和Ribo-seq。 文章思路 研究结果 1.m6A-seq分析发现强光诱导下叶绿体/光合基因转录本的m6A修饰发生显著变化 为验证m6A修饰是否与强光胁迫有关,作者首先用Dot blot以及LC-MS/MS分析了模式植物拟南芥在强光...
图2. m6A信号区可视化 ( m6A甲基化测序结果中的wig文件能够上传到基因组浏览器中,以便进行m6A信号区域的可视化。) 图3. MeRIP-qPCR检测各组细胞中ANPG m6A修饰水平差异。 图4. Dot Blot检测各组细胞中总m6A修饰水平,以亚甲基蓝染色作为RNA上样量内参。
该方法包括以下步骤:(1)低温下提取总 RNA;(2)纯化、富集得到目标RNA;(3)通过 Dotbotting检测目标RNA的m6A甲基化水平 ;其 中,步骤 (1)中,低温为2～8℃。本发明提供的方 法,在低温下获取RNA样品,能够保持组织内酶的 活性和细胞活度,避免了RNA的降解,通过控制离 心速度,缩短了提取时间,获得的RNA具有高完整 ...
技术路线：实验策略：图：微量MeRIP-seq实验流程 分析内容：送样要求：典型案例：真核生物mRNA中的m1A...
技术平台:m6A-seq(MeRIP-seq)、RNA-seq、m6A-RIP-qPCR 、qRT-PCR、Dot-blot、WB/IF等 研究摘要: 创面再上皮化受损会导致皮肤屏障重建功能障碍。m6A RNA修饰参与RNA命运决定,m6A甲基化变异会触发许多疾病发病机制。然而,m6A在创面再上皮化中的作用仍然未知。本研究构建ALKBH5-/-小鼠以研究ALKBH5敲除后创面再上皮...