CUT&Tag技术的核心是pAG-Tn5融合蛋白（ChiTag），其中Protein AG能够结合抗体。在进行CUT&Tag实验时，首先将细胞与磁珠混合，然后进行靶蛋白特异性抗体（一抗）孵育，使抗体进入细胞与靶蛋白结合。为了放大信号，接着进行二抗孵育。最后孵育pAG-Tn5转座体，使得转座体进入细胞并与抗体结合，这样就把转座体间接的固定在...
CUT&Tag是蛋白-DNA互作的一大革新技术,它不需要使用甲醛交联以及免疫共沉淀,而是通过针对靶蛋白(如转录因子、染色质重塑蛋白)的抗体和Protein A的介导,使得与Protein A融合的Tn5酶(Tagmentase)在切割DNA片段的同时在序列两端加上测序接头,经PCR扩增后形成可以直接用于高通量测序的文库(具体参考图1)。使用CUT&Tag,可以...
释放后的DNA片段会结合在磁珠上,含有的SDS需要清洗干净防止其干扰PCR建库。 图5.文库质检结果,片段集中在200-500bp 呈现周期性规律 最后让我们来看一下爱基的实测数据吧: 图6. CUT&Tag酶切片段分布,转录因子/组蛋白修饰的酶切片段分布呈现周期性; 图7. reads密度分布图,reads在TSS附近呈现明显的富集; 图8. ...
尽管CUT&Tag与ChIP方法在某些方面类似，但CUT&Tag实验的起始材料是活的可渗透细胞或分离的细胞核，而不是ChIP-seq中使用的甲醛交联的细胞或组织。CUT&Tag有望将蛋白与染色质DNA互作的研究变成了一种类似PCR反应的常规操作，对基因调控、表观遗传等领域的研究具有重要的意义。表 CUT&Tag与ChIP-seq比较 服务流程 服...
由于Tn5连有测序接头,在打断的同时直接在片段化的DNA上加接头,接着提取DNA,进行PCR扩增构建文库。 DAP-seq技术原理:将蛋白质体外表达与高通量测序技术结合,使用体外表达的TF蛋白对裸露的全基因组DNA片段进行孵育,以确定结合序列。主要步骤如下: 1. 文库构建:提取基因组DNA,进行基因组DNA文库构建。 2. 体外表达蛋白...
全速涡旋样品约10 sec，混匀后瞬离，将样品置于PCR仪，55 ºC消化2 h (热盖不低于70 ºC)或者37 ºC过夜。CUT&Tag-qPCR方案目前做CUT&Tag-qPCR时，有两种，一种是蛋白酶K消化和gDNA提取后直接qPCR实验，一种是完成建库后进行qPCR。这两种方式都有文献可参考。目前翌圣更推荐完成建库后进行qPCR实验。qP...
同时，研究中会通过选择CUT&Tag和RNA-seq结果中的一些代表性位点，设计特异性引物进行实时定量PCR验证，确认目标蛋白是否确实与这些位点结合，并且影响基因表达。以及，研究过程中，还可以通过基因敲除、过表达或RNA干扰等手段，改变目标蛋白的表达水平，观察下游基因表达和细胞表型的变化，间接验证结合位点的功能，确认其在...
同时CUT&Tag可以对极少量细胞(60个细胞)进行操作,实现单细胞测序。Protein A-Tn5在细胞内进行核酸切割,PCR之前的反应都在细胞内进行。Henikoff博士通过分配单个细胞到5184纳米孔,再加入带随机标签的引物进行扩增的办法,实现单细胞测序。 图5. 单细胞CUT&Tag测序流程(Henikoff,2019) Part III 翌圣CUT&Tag产品重磅上...
CUT&Tag对细胞的活性要求较高,原代细胞通常活性偏低,冻存复苏后的细胞活性很难达到送样要求,建议将新鲜组织清理冻存,及时送样。 细胞量很少时,应该怎么送样呢? 细胞量低至1000个细胞以下时,其送样与常规细胞量项目有区别,原则在于避免样本损失,我们建议:将细胞悬在10μL PBS中即可(使用低吸附的PCR管),液氮...
(1)CUT&Tag技术进行qPCR检测 事实证明,CUT&Tag实验所获取的DNA片段可以进行qPCR以检测目的条带的富集情况。CUT&Tag-qPCR与ChIP-qPCR类似,定量的长度、方法、引物设计等几乎完全一致。一般的实验流程为:细胞与磁珠结合—一抗孵育—二抗孵育—转座体孵育...