CUT&Tag:CUT&Tag是研究蛋白和DNA互作新兴的实验方法,该方法是通过蛋白特异性抗体引导Protein A-Tn5酶精确切割目标蛋白结合的DNA区域,并在这些序列的两端加上测序接头,经过PCR扩增后形成可用于高通量测序的文库,随后对文库进行测序分析从而解析与目标蛋白结合的DNA片段。CUT&Tag技术可以在单个细胞水平上进行高分辨率的蛋白...
在基于二代短读段测序平台的CUT&Tag相关技术研究中,Tn5转座酶需要分别在具有染色质修饰(组蛋白修饰或转录因子结合)的基因组DNA的两侧进行转座,从而在短DNA片段(通常为200bp-500bp)的两端连接上测序接头,且只有双端带有不同测序接头的短D...
由于Tn5酶连有测序接头，在打断的同时直接在片段化的DNA上加接头，接着提取DNA，进行PCR扩增构建文库。PCR产物经过1.3X磁珠进行纯化，再经Agilent 2100分析仪(Agilent Technologies)用Quant-iTTM dsDNA HS分析试剂盒(Invitrogen，MA，USA)和qPCR对文库进行片段范围及有效浓度检测。3、文库质检 我们对文库的质检主要包括...
如图1所示,该技术和CUT&RUN一样,都是利用刀豆素A磁珠(ConA磁珠)来捕获细胞,但是该方法是通过转录因子等蛋白特异性抗体引导Protein A/G-Tn5转座酶对目标染色质区域进行切割,同时在序列两端加上测序接头,通过PCR扩增后形成用于高通量测序的文库。 图1.CUT&Tag原理。 Tn5转座酶工作原理: 如图2所示,当转座事件发生时,...
全速涡旋样品约10 sec，混匀后瞬离，将样品置于PCR仪，55 ºC消化2 h (热盖不低于70 ºC)或者37 ºC过夜。CUT&Tag-qPCR方案目前做CUT&Tag-qPCR时，有两种，一种是蛋白酶K消化和gDNA提取后直接qPCR实验，一种是完成建库后进行qPCR。这两种方式都有文献可参考。目前翌圣更推荐完成建库后进行qPCR实验。qP...
由于Tn5酶连有测序接头,在打断的同时直接在片段化的DNA上加接头,接着提取DNA,进行PCR扩增构建文库。PCR产物经过1.3X磁珠进行纯化,再经Agilent 2100分析仪(Agilent Technologies)用Quant-iTTM dsDNA HS分析试剂盒(Invitrogen,MA,USA)和qPCR对文库进行片段范围及有效浓度检测。
与ChIP-seq相同的是都需要利用抗体识别并结合目标蛋白，不同点在于CUT&Tag技术是利用Tn5转座酶与Protein A/G的融合蛋白，通过二抗把Tn5酶复合体引导至目标染色质区域，Tn5转座酶在剪切DNA的同时，在插入位点连接adapter，再通过PCR扩增制备文库（图1）。与ChIP-seq相比，CUT&Tag具有显著优势，如：信噪比高，可重复性...
同时CUT&Tag可以对极少量细胞(60个细胞)进行操作,实现单细胞测序。Protein A-Tn5在细胞内进行核酸切割,PCR之前的反应都在细胞内进行。Henikoff博士通过分配单个细胞到5184纳米孔,再加入带随机标签的引物进行扩增的办法,实现单细胞测序。 图5. 单细胞CUT&Tag测序流程(Henikoff,2019) Part III 翌圣CUT&Tag产品重磅上...
CUT&Tag 是蛋白质-DNA 互作关系研究的新方法，能在全基因组范围内检测与组蛋白、转录因子等互作的DNA片段，是新一代超微量ChIP-Seq技术，适用于无ChIP级别抗体的蛋白研究。CUT&Tag 有望将蛋白与染色质 DNA 互作的研究变成了一种类似 PCR 反应的常规操作，对基因调控、表观遗传等领域的研究具有重要的意义。2.CUT...
CUT&Tag以融合了protein A/G的Tn5转座酶为核心,融合蛋白通过protein A/G与抗体结合,使得Tn5被栓系在靶位点周围,从而在目的位点附近进行酶切反应,并同时引入二代测序所必需的接头序列,产物DNA经过后续提取与PCR扩增后,得到直接用于测序的文库。CUT&Tag与传统的ChIP-Seq技术相比较,实验不需要超声打断,也不需要传统的...