2、随后对染色质进行提取和片段化(超声打断或酶切),此时取出一部分染色质(一般是2%Input),对DNA进行纯化,即为Input; 3、对部分染色质进行目标蛋白抗体的孵育与磁珠富集,解交联后纯化DNA,即为IP;同时,另一部分染色质进行IgG抗体的富集,为IgG样本。 4、对Input、IP进行建库和测序可进行ChIP-seq
阴性对照:使用无关基因组区域或IgG抗体(非特异性抗体)排除背景噪音。 实验重复:建议至少3次生物学重复,确保结果可重复性。 结果分析与解读 ChIP-qPCR的数据分析需关注两种富集度计算方式: 百分比输入法:将目标区域Ct值换算为占输入DNA的比例,公式为: [ \text{富集度} = 2^{(\text{Ct}{...
Percent Input法需要引入CUT&Tag实验流程并不需要的Input,因此不适用于CUT&Tag-qPCR的实验结果计算。Fold Enrichiment法引入了IgG,IgG理论上是不能特异性富集任何DNA片段,因此IgG可以作为阴性对照参与计算富集倍率,这不仅能够用于对照组和处理组相对富集倍率的计算,也能够满足单组单基因的富集验证,计算方法与常规qPCR类似...
第2步的作用是计算每个样品的富集倍数,也就是抗体拉下来的DNA的量,和input相比,百分比是多少;3-4步是指向对于阴性对照(IgG)来说,目标蛋白的抗体来下DNA是多少倍于IgG拉下来的背景值;5-6步是计算两个样品之间的比值的。 qPCR的结...
阴性对照管:一般可以取 ChIP缓冲液稀释后的目的蛋白管相同含量的染色质作为阴性对照管样本,然后加入正常同型 IgG 抗体(例如,目的蛋白管所用的 ChIP抗体如果为兔抗,此时就需要用正常兔 IgG,加入正常兔 IgG 抗体量与目的蛋白的 ChIP级抗体量相同)。 阳性对照管:一般可以取 ChIP缓冲液稀释后的目的蛋白管相同含量的染...
PCR 反应应当包括靶蛋白抗体Anti-target IP样品、阴性对照 Normal Mouse/Rabbit IgG样品、监控 DNA 污染的不含 DNA 模板的空白对照和 1% 输入对照Input组染色质 DNA 的连续稀释物(未稀释、1:5、1:25、1:125),以生成标准曲线并测定扩增效率(扩增效率的测定是可选做的)。
阳性对照的蛋白为H3K27ac,qPCR检测基因序列为GAPDH-promoter区。阴性对照的蛋白为Rabbit IgG,qPCR检测基因序列为GAPDH-promoter区。 可联系我们 广州铭锐科技有限公司是一家致力于提供生命科学研究相关耗材、仪器的供应商,同时提供高质量实验技术服务的公司。主要技术服务内容:ChIP、DNA pull-down 、RIP、RNA pull-down...
那最后这三组DNA需要测浓度,一般来说,转录因子的浓度会稍微低一些,一般input会是几十ng/ul,抗体组和igG组的DNA一般为几ng/ul(如果你拉下来的DNA需要送公司测序,一般要求浓度为10ng/ul以上,总量为20ng以上;那测序之后下机的数据如何分析,请看这个操作...
2️⃣ IP组vs IgG组,显著富集意味着蛋白结合启动子。 3️⃣ qPCR计算方法: - △Ct [normalized ChIP] = (Ct - (Ct - Log2(Input Dilution Factor))) - Input Dilution Factor = (fraction of the Input chromatin saved) ^-1 (通常为50) - △△Ct [ChIP/NIS] = △Ct [normalized ChIP...
常规过表达单组(Ab IP vs IgG IP);动态互作组学(实验组vs对照组vs IgG组)。根据目的设计适当的生物学重复。如果后续以ChIP-Seq数据进行互作组标准分析,则需要3-4组生物学重复;如果后续以寻找关键互作DNA片段,进行深入的机制研究,则建议1-2次生物学重复。根据经验,单次重复假阳性率达90%。ChIP-Seq强烈建议设置...