蛋白印迹,也称Western,Western blot、Western blotting、Western印迹,是检测蛋白的重要方法之一。经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或...
3)按照每4 μL蛋白样品加入1μl 5XSDS-PAGE 蛋白上样缓冲液的比例,混合蛋白样品和5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。 4)100℃或沸水浴加热 3-5min,以充分变性蛋白,之后冷却至室温备用。 5)在每个样品孔中上样20-40 g蛋白,并在1个孔中上样蛋白marker,盖上电泳槽盖,打开电源,推荐使用低压100V,跑15min,之后换...
一般的脱脂奶粉中含有大量的酪蛋白,是一种磷酸化蛋白,如果要WB检测磷酸化蛋白的话,就最好别用脱脂奶,否则会产生高背景(当然很多人用牛奶封闭出现问题也可能是因为用了非实验级奶粉)。根据经验来看,WB检测磷酸化蛋白时,BSA的封闭效果比脱脂牛奶好。 ③抗体孵育 一抗4 ℃过夜,二抗室温1 h 因为磷酸化蛋白只占总蛋...
WB常规实验流程:蛋白提取→蛋白定量→制胶→电泳→转膜→封闭→一抗孵育→一抗洗脱→二抗孵育→二抗洗脱→化学发光→数据分析。 WB实验流程图 (图片来自网络,侵联删) 二、WB实验试剂配置 在实验开始之前,可以按以下配方比例配置实验所需试剂。 1 电泳缓冲...
1)大分子蛋白 大分子蛋白一般指WB检测中分子量>200kDa的蛋白质,由于其分子量大,迁移速度慢,转膜困难等特征,这类蛋白质的迁移和转移可能会受到影响,因而在WB实验中有时难以获得清晰条带。 2)小分子蛋白 小分子蛋白主要指WB检测中分子量<20kDa的蛋白质,由于分子量小易降解,且带电荷量也相对较少,所以导致其吸附能...
一、WB实验的基本原理：蛋白质免疫印迹(Western Blot)是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。一个基因表达终极结果是产生相应的蛋白质(或酶)。因此检测蛋白质是测定基因表达的主要标志，检测蛋白质的方法很多，除 ELISA 法外，也可用与检测 DNA 和 RNA 相类似的吸印方法。与Southern或Northern杂交方法...
WB实验、SDS-PAGE凝胶电泳常用为变性蛋白上样缓冲液,非变性蛋白上样缓冲液仅适用于天然蛋白的研究分析。市面上常见的变性蛋白上样缓冲液根据使用比例可分为:1×、2×、4×、5×几种,根据还原剂的不同变性蛋白上样缓冲液一般分为β-ME款、DTT款、TCEP款,目前科研端使用最多的产品为DTT款、TCEP款。
膜蛋白WB相对于其他蛋白更加困难,主要原因有: 提取困难:膜蛋白与膜结合紧密,不易从膜上洗涤下来,特别是跨膜蛋白,具有多重跨膜结构域,提取分离困难,样品质量差导致WB失败。 表达量低:膜蛋白在样品中的表达量通常不高,在总蛋白中占比较低,用总蛋白检测时,目标蛋白含量可能低于WB检测下限,无法检测到。
蛋白质印迹（Western Blot, WB）又称为免疫印迹（Immunoblot），是利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）将样品中分子量大小不同的蛋白分开，然后通过电转移的方法将凝胶中的蛋白定量地迁移并几乎原位复制、固定到固相膜上，再利用抗原、抗体的特异性结合反应，特殊的抗体标记技术以及相应的检测方法，进而对目的蛋白进行...
想必大家对各种分析蛋白的方法都有所耳闻,如我们常用到Western blot(WB)、流式细胞术,及免疫组化(IHC)等。WB常被认为是检验蛋白表达的金标准,可用于检测细胞多种类型的蛋白表达,然而并非所有的蛋白分析技术都是WB能解决的,如想了解蛋白在细胞的表达位置,单个细胞水平上蛋白的表达情况如何?这都需要借助其他的技术手...