,也称Western,Western blot、Western blotting、Western印迹,是检测蛋白的重要方法之一。经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记...
WB常规实验流程:蛋白提取→蛋白定量→制胶→电泳→转膜→封闭→一抗孵育→一抗洗脱→二抗孵育→二抗洗脱→化学发光→数据分析。 WB实验流程图 (图片来自网络,侵联删) 二、WB实验试剂配置 在实验开始之前,可以按以下配方比例配置实验所需试剂。 1 电泳缓冲...
一般的脱脂奶粉中含有大量的酪蛋白,是一种磷酸化蛋白,如果要WB检测磷酸化蛋白的话,就最好别用脱脂奶,否则会产生高背景(当然很多人用牛奶封闭出现问题也可能是因为用了非实验级奶粉)。根据经验来看,WB检测磷酸化蛋白时,BSA的封闭效果比脱脂牛奶好。 ③抗体孵育 一抗4 ℃过夜,二抗室温1 h 因为磷酸化蛋白只占总蛋...
膜蛋白WB相对于其他蛋白更加困难,主要原因有: 提取困难:膜蛋白与膜结合紧密,不易从膜上洗涤下来,特别是跨膜蛋白,具有多重跨膜结构域,提取分离困难,样品质量差导致WB失败。 表达量低:膜蛋白在样品中的表达量通常不高,在总蛋白中占比较低,用总蛋白检测时,目标蛋白含量可能低于WB检测下限,无法检测到。 易形成多聚...
蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)是将蛋白质经电泳分离后转移到膜上,然后利用抗体进行检测的技术。完整的WB流程,如下图所示,包含样本制备、SDS-PAGE、转膜、抗体结合、蛋白检测等5个大步骤。 样品制备 1、蛋白提取 1)融解RIPA裂解液,混匀。取适当量的裂解液,在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为1 mM。
一、WB实验的基本原理：蛋白质免疫印迹(Western Blot)是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。一个基因表达终极结果是产生相应的蛋白质(或酶)。因此检测蛋白质是测定基因表达的主要标志，检测蛋白质的方法很多，除 ELISA 法外，也可用与检测 DNA 和 RNA 相类似的吸印方法。与Southern或Northern杂交方法...
WB实验,是一种常用的蛋白分析技术。实验中每一步的把握,将会直接影响结果的显现。本文将给大家展示WB实验的详细操作步骤。 蛋白样品的提取及蛋白含量的检测 蛋白样品的好坏,直接决定了能否做出来蛋白条带,所以蛋白样品的提取需严格按照试剂盒说明书进行。
免疫印迹，又被称为蛋白质印迹（Western blot，WB），是一种复合性的免疫学检测技术。该方法通过利用SDS-PAGE技术，在生物样本中将蛋白质分子根据其分子量在凝胶上进行分离，随后通过电转移的方式将这些蛋白质转移到固相膜上。固相膜上的蛋白质充当抗原，与相应的抗体发生免疫反应，接着与酶标记的第二抗体发生反应。...
4)分子量大:部分膜蛋白分子量较大,大分子量蛋白WB,电泳,转膜等条件需要摸索,较为困难。 面对膜蛋白我们应该如何处理? 1、了解自己研究蛋白的特性 可以通过uniprot、topcons、The Human Protein Atlas等工具,结合文献检索,了解研究蛋白的在组织及各种细胞中的表达量、是否属于跨膜蛋白等,表达量较高且不属于跨膜蛋白...