Marker孔加入5-10μL,其余蛋白总上样量30-50μg. 电泳 接上电源后,先用80V恒压电泳至溴酚蓝指示剂到浓缩胶与分离胶交界处,成线状,改为恒压120v直至溴酚蓝电泳到凝胶底部,此过程约用时1.5h。 小贴士:根据实验要求可以进行适当调整,蛋白条带较大时,可...
WB实验的基本核心理念是抗原抗体的特异性反应,通过变性胶 SDS-PAGE 将不同分子量的蛋白质分离开,然后转移到固相载体 PVDF 膜上,再用脱脂牛奶作为封闭液进行封闭和一抗稀释液进行稀释。待目的蛋白和抗体充分结合后,用 TBST 洗脱液洗脱掉多余未结合的一抗,...
我习惯先上蛋白Marker,再上蛋白样品,蛋白上样前确保样品完全解冻和充分振荡(推荐使用振荡器振荡),吸的时候没有拉丝即可,建议上样前五分钟把样品从冰上取出来,不然样品中SDS可能会结晶析出,从而影响电泳效果。上层胶80V 25-30分钟,下层胶120V 60-65分钟。以下是正常电泳示例: 溴酚蓝准备进入下层胶(marker 未分开,...
蛋白免疫印迹（Western Blot，WB）是一种将蛋白样本通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，再转移到杂交膜上，然后利用一抗-二抗复合物对特定蛋白进行特异性检测的方法。它已成为蛋白质分析领域中最受欢迎且技术成熟的方法之一。在WB实验中，蛋白样品的制备是至关重要的第一步，其成功与否直接决定着实验的最终结果。蛋白提取...
小分子蛋白主要指WB检测中小于20kDa的蛋白质,由于分子量小易降解,且带电荷量也相对较少,所以导致其吸附能力比较弱。常用的蛋白WB步骤通常会导致检测结果不稳定,时有时无,甚至出现转膜失败,蛋白弥散等完全看不到目标条带的情况。针对小分子蛋白的WB检测,应该对实验步骤进行优化,以提高结果的准确性。
一、WB实验的基本原理：蛋白质免疫印迹(Western Blot)是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。一个基因表达终极结果是产生相应的蛋白质(或酶)。因此检测蛋白质是测定基因表达的主要标志，检测蛋白质的方法很多，除 ELISA 法外，也可用与检测 DNA 和 RNA 相类似的吸印方法。与Southern或Northern杂交方法...
WB实验步骤 【组织或细胞蛋白提取】进行蛋白提取时，我们可以采用多种方法，包括匀浆和离心技术。对于组织的裂解，通常需要将其用预冷的PBS洗涤，然后通过匀浆和离心来分离细胞和提取蛋白。对于悬浮细胞，用PBS重悬后离心去除上清液，再加入完全裂解液进行裂解。贴壁细胞则需要先去除培养基，再通过加入PBS和细胞刮刀辅助...
实验步骤 1.准备样品，进行SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳后不要染色，直接进行转膜。2.转膜：转一张膜需准备 6 张 7.0～8.3 cm 的滤纸和 1 张 7.3～8.6 cm 的硝酸纤维素膜。将切好的硝酸纤维素膜置于转膜液中浸 20 min才可使用。在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支...
WB实验全攻略：从样品制备到蛋白检测，一文掌握所有关键技术 WB，即Western Blot，被誉为蛋白质免疫印迹，是一种利用抗原抗体特异性结合进行半定量检测的技术。它广泛应用于分子生物学、生物化学以及免疫遗传学领域。尽管这一技术看似并不复杂，但常常因种种因素而难以获得理想的结果图，甚至可能导致实验失败。然而，有...
1、实验原理 WB是一种把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持物（NC膜或PVDF膜），并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测。WB采用抗体作为探针，抗体可以与附着在固相支持物的靶蛋白的抗原表位发生抗原-抗体免疫反应。这种技术的作用是对细胞或组织提取的蛋白混合物（即总蛋白混合物）中的某一特异蛋白...