WB常规实验流程:蛋白提取→蛋白定量→制胶→电泳→转膜→封闭→一抗孵育→一抗洗脱→二抗孵育→二抗洗脱→化学发光→数据分析。 WB实验流程图 (图片来自网络,侵联删) 二、WB实验试剂配置 在实验开始之前,可以按以下配方比例配置实验所需试剂。 1 电泳缓冲...
,也称Western,Western blot、Western blotting、Western印迹,是检测蛋白的重要方法之一。经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记...
膜蛋白WB相对于其他蛋白更加困难,主要原因有: 提取困难:膜蛋白与膜结合紧密,不易从膜上洗涤下来,特别是跨膜蛋白,具有多重跨膜结构域,提取分离困难,样品质量差导致WB失败。 表达量低:膜蛋白在样品中的表达量通常不高,在总蛋白中占比较低,用总蛋白检测时,目标蛋白含量可能低于WB检测下限,无法检测到。 易形成多聚...
小分子蛋白主要指WB检测中小于20kDa的蛋白质,由于分子量小易降解,且带电荷量也相对较少,所以导致其吸附能力比较弱。常用的蛋白WB步骤通常会导致检测结果不稳定,时有时无,甚至出现转膜失败,蛋白弥散等完全看不到目标条带的情况。针对小分子蛋白的WB检测,应该对实验步骤进行优化,以提高结果的准确性。 上样 通常Western...
但是预染蛋白Marker经过化学修饰后在SDS-PAGE电泳过程中迁移率发生改变,分子量信息不再准确,往往导致WB结果判断出现一些偏差,不太适合精确定位蛋白。再加上膜分子孔径以及膜对不同物质吸附能力的差异,预染蛋白Marker由于共价偶联了染料分子和非染色蛋白Marker在膜上的吸附能力是有差异的,就无法...
一、WB实验的基本原理：蛋白质免疫印迹(Western Blot)是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。一个基因表达终极结果是产生相应的蛋白质(或酶)。因此检测蛋白质是测定基因表达的主要标志，检测蛋白质的方法很多，除 ELISA 法外，也可用与检测 DNA 和 RNA 相类似的吸印方法。与Southern或Northern杂交方法...
蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)是将蛋白质经电泳分离后转移到膜上,然后利用抗体进行检测的技术。完整的WB流程,如下图所示,包含样本制备、SDS-PAGE、转膜、抗体结合、蛋白检测等5个大步骤。 样品制备 1、蛋白提取 1)融解RIPA裂解液,混匀。取适当量的裂解液,在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为1 mM。
WB实验需要对样品总蛋白进行定量,主要目的是对样品进行均一化处理,也就是使各个泳道蛋白总上样量一致。 特别提醒这里的总上样量一致,是以质量单位上样(ug/孔)而不是以体积单位上样(ul/孔)。 举个例子 看下图目的蛋白表现出了表达量的差异性! 再看一下内参的表达量: ...
4)分子量大:部分膜蛋白分子量较大,大分子量蛋白WB,电泳,转膜等条件需要摸索,较为困难。 面对膜蛋白我们应该如何处理? 1、了解自己研究蛋白的特性 可以通过uniprot、topcons、The Human Protein Atlas等工具,结合文献检索,了解研究蛋白的在组织及各种细胞中的表达量、是否属于跨膜蛋白等,表达量较高且不属于跨膜蛋白...