CRISPR-Cas9基因编辑技术主要有两种应用方式: 1.基因敲除(Knockout):通过CRISPR-Cas9在目标基因上引入双链断裂(DSB),细胞通过非同源末端连接(NHEJ)修复机制修复断裂,过程中可能引入插入或缺失(indels)突变,导致目标基因功能丧失。 2.基因插入或替换(Knockin):利用同源重组(HDR)机制,在目标基因上引入特定的突变或外源序...
由于CRISPR-Cas9 系统中的核酸内切酶切割特异性由 RNA 序列引导,因此通过对向导 RNA (gRNA) 序列进行工程改造,并将其与 Cas9 核酸内切酶一起递送至靶细胞内后,几乎可以对任何基因组位点进行编辑。 CRISPR 是如何工作的? CRISPR-Cas9 系统由非编码短 gRNA 和 Cas9 核酸酶组成(图 1)。...
其中CRISPR/Cas9系统是研究最深入,应用最成熟的一种高效的基因编辑工具,主要由Cas9和由tracrRNA和crRNA形成的sgRNA组成。 CRISPR/Cas9系统一般有质粒DNA(pDNA),RNA或Cas9核糖核蛋白(RNP)三种不同生物形式,其中pDNA CRISPR/Cas9系统是最常用一种形式。 CRISPR/Cas9系统应用...
CRISPR-Cas9基因编辑技术就是通过人工设计的 sgRNA(guide RNA)来识别目的基因组序列,并引导 Cas9 蛋白酶进行有效切割 DNA 双链,形成双链断裂,损伤后修复会造成基因敲除或敲入等,最终达到对基因组DNA 进行修饰的目的。 CRISPR-Cas9的广泛应用 1、基因敲除(Knock-out) ...
CRISPR-Cas9 技术能够用来修复致病的基因突变。在这个情形下，科学家把外源的修复模板弄进细胞里，借助 HDR 修复机制达成对基因的精准修复。修复模板一般就是一段有着目标基因正确序列的 DNA 片段。Cas9 蛋白质在目标位点造成 DSB 以后，修复模板会被拿来当作 DNA 修复的模板。通过这种办法能够把基因里的突变纠正过来...
CRISPR-Cas9基因编辑载体构建 在植物中进行基因编辑通常需要同时构建Cas基因表达盒和sgRNA表达盒。Cas基因的表达通常由35S或Ubi等RNA聚合酶II启动子驱动,以Nos终止子或其他终止子终止;sgRNA表达盒比较小,一般由长约300 bp的U3或U6等RNA聚合酶III启动子驱动,以连续6个以上的T碱基终止即可。目前常用的基因编辑载体骨架所...
CRISPR/Cas系统可以识别出外源DNA,并将它们切断,沉默外源基因的表达。这与真核生物中RNA干扰(RNAi) 的原理是相似的。正是由于这种精确的靶向功能, CRISPR/Cas系统被开发成一种高效的基因编辑工具。在自然界中,CRISPR/Cas系统拥有多种类别,其中CRISPR/Cas9系统是研究最深入,应用最成熟的一种类别。 CRISPR/Cas9是继...
CRISPR-Cas9基因编辑技术,通过向导RNA(gRNA)将Cas9酶靶向目标DNA序列,Cas9酶切割目标DNA双链,造成DNA双链断裂,DNA在非同源末端连接(NHEJ)修复时出错,从而实现基因敲除。 然而,CRISPR-Cas9存在较为严重的脱靶效应,可能会在错位的基因位点切割DNA双链,从而导致潜在风险,这也是限制CRISPR-Cas9基因编辑临床应用的一大因素。
综上，CRISPR 技术主要是利用位点特异 Cas 核酸酶在基因组靶位点处引入 DNA DSB，再经细胞自身的非同源末端连接 (NHEJ) 或同源重组修复 (HDR) 对 DSB 进行修复，最终实现目标基因敲除和碱基编辑等基因组遗传修饰。CRISPR/Cas9 的小分子调控策略 CRISPR 技术在疾病治疗、基因功能调控、药物研发等多个方面具有广阔的...