CRISPR-Cas9 技术的效率是个很关键的挑战。虽说 Cas9 蛋白质能够把目标 DNA 切开，可修复过程的效率却不高。尤其是 HDR 修复机制，效率特别低，原因是在细胞里 NHEJ 修复机制更常见。科学家们努力的方向在于提升 CRISPR-Cas9 技术的效率，像优化 sgRNA 的设计呀、改良 Cas9 蛋白质的性能啊，还有寻找更管用的修复...
由于CRISPR-Cas9 系统中的核酸内切酶切割特异性由 RNA 序列引导,因此通过对向导 RNA (gRNA) 序列进行工程改造,并将其与 Cas9 核酸内切酶一起递送至靶细胞内后,几乎可以对任何基因组位点进行编辑。 CRISPR 是如何工作的? CRISPR-Cas9 系统由非编码短 gRNA 和 Cas9 核酸酶组成(图 1)...
crispr-cas9系统由非编码短 grna和 cas9核酸酶组成( 图 1 ).grna有两个分子组分:一个靶点特异性 crispr rna (crrna)和一个辅助性的反式激活 crrna (tracrrna).grna单元将 cas9蛋白引导至特定基因组位点,cas9核酸酶在该位点诱导特定基因组靶序列的双链断裂( 图 2 ). 图 1.cris...
Cas9 蛋白包含两个核酸酶结构域：切割非互补 DNA 链的 RuvC 结构域和切割互补 DNA 链的 HNH 结构域 （如图 2a）。噬菌体等外源 DNA 入侵时，CAS 蛋白复合物通常识别 3' 端含 NGG 的前间隔序列邻近基序 （PAM） 区域。然后，侵入的噬菌体或质粒释放的短 DNA 片段（称为 Protospacer），插入宿主 CRISPR 位点...
CRISPR-Cas9基因编辑技术主要有两种应用方式: 1.基因敲除(Knockout):通过CRISPR-Cas9在目标基因上引入双链断裂(DSB),细胞通过非同源末端连接(NHEJ)修复机制修复断裂,过程中可能引入插入或缺失(indels)突变,导致目标基因功能丧失。 2.基因插入或替换(Knockin):利用同源重组(HDR)机制,在目标基因上引入特定的突变或外源序...
报道称，CRISPR/Cas9系统是原核生物（细菌和古细菌等）拥有的一种防御机制。这些单细胞生物没有明确的细胞核，其遗传物质分散在细胞内。它到底是什么？报道指出，这种防御机制使这些生物能够以一种延续不断且非常有效的方式防御病毒侵袭。相比之下，为了获得针对病毒的免疫力，人类需要一代又一代地接种疫苗，因为我们...
CRISPR-Cas9是继ZFN、TALENs等基因编辑技术推出后的第三代基因编辑技术,短短几年内,CRISPR-Cas9技术风靡全球, 成为现有基因编辑和基因修饰里面效率最高、最简便、成本最低、最容易上手的技术之一,成为当今最主流的基因编辑系统。 一、什么是CRISPR-Cas系统 ...
其中CRISPR/Cas9系统是研究最深入,应用最成熟的一种高效的基因编辑工具,主要由Cas9和由tracrRNA和crRNA形成的sgRNA组成。 CRISPR/Cas9系统一般有质粒DNA(pDNA),RNA或Cas9核糖核蛋白(RNP)三种不同生物形式,其中pDNA CRISPR/Cas9系统是最常用一种形式。 CRISPR/Cas9系统应用...
【图4】CRISPR/Cas9介导的重组工程 [3] 在重组工程中,我们是将线性DNA (单链或双链) 电转到含有λ-Red重组酶的宿主细胞中,线性DNA一旦进入细胞便会在重组酶的驱动下参与同源重组,λ-Red重组酶是在制备感受态细胞的过程中诱导表达的。 在CRISPR/Cas9介导的重组工程中,我们需要将线性DNA和组成型表达sgRNA的质粒一...