在定量PCR(也称rt-PCR或qPCR)中,荧光信号是由荧光探针或荧光DNA结合染料(如SYBR Green)产生,其强度与PCR产物分子(扩增子)的数量成正比。每个循环结束时,收集荧光信号强度,通过将荧光强度与循环数作图,qPCR仪生成扩增曲线,其表示在整个PCR过程中产物的累积,通过这个过程,即可实现量化。如果样品中特定的序列(DNA或RNA)...
1、荧光染料法（SYBR Green）：SYBR Green Ⅰ是荧光定量PCR中最常用的荧光染料，它能与所有的双链DNA...
2 随后,SYBR Green染料会与每一个新产生的双链DNA分子进行结合。 3 随着PCR的进行,越来越多的扩增子被生成。由于SYBR Green染料可与所有的双链DNA结合,因此荧光强度也会随着PCR产物的增加而增加。 图1 SYBR Green 染料法实验原理示意图(https://www.thermofisher.cn/cn/zh/home/life-science/pcr/real-time-p...
染料法一般使用的是SYBR Green I染料,这是一种可以与双链DNA小沟结合的荧光染料,其不会与单链DNA结合,且在游离状态下几乎无荧光,只有与双链DNA结合才会发出荧光,因此将PCR扩增产生的双链DNA数量与荧光强度直接关联,产生实时监测的效果。 SYBR Green染料法优点 ...
1、 DNA结合染料—SYBR Green I 法 • 原理:SYBR Green I 是一种DNA结合染料,其与双链DNA结合后,荧光大大增强,DNA与染料结合所释放的荧光量与dsDNA的数量成正比。因此,检测到的荧光信号可反映出PCR体系存在的双链DNA数量。 • 特征:可逆荧光,最大吸收波长497nm,最大发射波长520nm。
SYBR Green I法是进行定量qpcr实验的常用方法,本文介绍了SYBR Green I法的原理、优缺点,以及进行定量qPCR的常见问题和解决方法。 一.SYBR Green I法原理 1.Sybr Green I是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料,在PCR反应体系中,Sybr荧光染料特异性地掺入DNA双链与双链DNA结合后,发射荧光信号,而不掺入双链中的...
以下是sybr green染料法的引物设计原则: 一、引物长度 1. 引物长度一般在18-24个碱基对之间。过长的引物可能使PCR反应失败,而过短的引物可能导致非特异性扩增。 二、引物Tm值 2. 引物的Tm值应该尽量接近。Tm值的计算可以通过一些软件如OligoCalc或Primer3进行预测。Tm值的差异过大可能会导致引物的不对称性,从而...
SYBR Green I方法 SYBR Green I方法是目前最为常见的荧光染料,其作用原理为:SYBR Green I是一种只与双链DNA小沟结合的染料,并不与单链DNA链结合,而且在游离状态不发出荧光,只有掺入DNA双链中才可以发光,因此,在PCR体系中,随着特异性PCR产物的指数扩增,每个循环的延伸阶段,染料掺入双链DNA中,其荧光信号强度与...
SYBR Green染料法相对定量qPCR实验 实时荧光定量PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 实验材料:动物组织或血液 试剂/试剂盒:RNA提取试剂盒、Quantscript RT Kit试剂盒、荧光定量PCR Mix (SYBRGreenRealtimePCRMasterMix)、TRIZON...