常规流程为先借助单细胞分选技术分离出单个细胞,之后将单个细胞转移至低渗裂解缓冲液(裂解液中含有RNase抑制剂)中进行裂解,裂解液中有带有通用5'锚定序列的oligo(dT)寡核苷酸和游离dNTP,可以初步对带有polyA结构的mRNA和部分lncRNA进行捕获。但也有些单细胞分选平台将上述流程改进为一个完整的模块,可以一步从单细胞...
2. 单个GEM依次形成后再全部混合,细胞裂解,凝胶珠自动溶解释放大量引物序列。 3. 释放的引物中包含30nt poly dT反转录引物,带有polyA的RNA被反转录为带有10X Barcode和UMI信息的cDNA一链,再以SMART方式完成二链合成。 4. 油滴破碎,磁珠纯...
2. 单个GEM依次形成后再全部混合,细胞裂解,凝胶珠自动溶解释放大量引物序列。 3. 释放的引物中包含30nt poly dT反转录引物,带有polyA的RNA被反转录为带有10X Barcode和UMI信息的cDNA一链,再以SMART方式完成二链合成。 4. 油滴破碎,磁珠纯化cDNA一链,然后PCR扩增cDNA。 5. cDNA扩增完成后酶切片段化并磁珠筛选最...
带有polyA的RNA被反转录为带有10x Barcode和UMI信息的cDNA一链，再以SMART方式完成二链合成。
3、反转录(一链合成):使用Oligo(dT) primer 对带有polyA尾的RNA( 主要是mRNA )进行反转录。由于使用了鼠源的反转录酶( Moloney Murine Leukemia Virus )进行反转录,所以会在cDNA链3'端加上三个C。 4、模板置换(二链合成):该步使用TSO ( template-switching...
通过带有oligo-dT的引物特异的抓取含有polyA尾的mRNA,随后进行反转录,当反转录酶到达RNA的5‘末端时会在反转出来的cDNAD 3'末端额外的添加2-5个碱基C。反转录体系中的TSO(template-swiching oligo)序列凭借其3’末端含有的3个G,会与cDNA互补配对,M-MLV反转录酶能够自动切换模板,并在cDNA的3‘端合成TSO的互补序...
反转录( 一链合成 ):使用Oligo(dT) primer对带有polyA尾的RNA(主要是mRNA)进行反转录。由于使用了鼠源的反转录酶(Moloney Murine Leukemia Virus)进行反转录,所以会在cDNA链3'端加上三个C 模板置换( 二链合成 ):该步使用TSO ( template-switching oligo ) 引物合成了cDNA的二链,从而置换了与一链cDNA互补的...
The current limitations are the lack of strand specificity and the inability to detect nonpolyadenylated (polyA(-)) RNA.SimonePicelliOmid RFaridaniAsa KBj?rklundG?staWinbergSvenSagasserNature protocolsPicelli S, Faridani OR, Bjorklund AK, Winberg G, Sagasser S, Sandberg R. 2014. Full-length...
Here we present a detailed protocol for G&T-seq, a method for separation and parallel sequencing of genomic DNA and full-length polyA(+) mRNA from single cells. We provide step-by-step instructions for the isolation and lysis of ... IC Macaulay,MJ Teng,W Haerty,... - 《Nature Protocols...
Description of the bug I'm trying to process bulk Smart3-seq data using the pipeline (related Slack discussion here). In my case, the FASTQ read structure is the following: R1: 6N UMI - GGG - transcript [- polyA - adaptors] R2: 6N UMI - ...