1. sgRNA设计基础 核心作用sgRNA(single guide RNA)是CRISPR基因编辑系统的核心组件,负责引导Cas9蛋白靶向特定DNA序列并切割。关键结构: 20nt靶向序列:与目标DNA互补配对支架区(scaffold):结合Cas9蛋白 设…
并且与Cas9蛋白兼容。SgRNA scaffold设计:sgRNA scaffold是一个特定的RNA结构，它与SGRNA结合并促进Cas9蛋白...
一种双碱基突变的高活性sgrna骨架,将其命名为sgrna(ttat)scaffold,其核苷酸序列如seq.id.no.1所示。 一种双碱基突变的高活性sgrna骨架载体,将其命名为pu6-sgrna(ttat)scaffold,其核苷酸序列如seq.id.no.4所示。 一种靶向目标基因的高活性sgrna骨架载体,是在上述pu6-sgrna(ttat)scaffold上,利用粘性末端连入靶向...
3.sgRNA结构设计:根据目标序列和PAM序列,设计出具有特定结构的sgRNA。这通常包括一个与目标序列互补的间隔区(spacer)和一个与Cas9蛋白结合的支架区(scaffold)。间隔区的序列必须与目标DNA完全匹配,以确保特异性。 4.效率评估:设计好的sgRNA需要通过实验验证其编辑效率。这可以通过细胞实验、动物模型或基因测序等方法进行。
在设计sgRNA时,必须确保目标序列紧邻PAM序列,以便Cas9蛋白能够准确识别并切割。 3.sgRNA结构设计:根据目标序列和PAM序列,设计出具有特定结构的sgRNA。这通常包括一个与目标序列互补的间隔区(spacer)和一个与Cas9蛋白结合的支架区(scaffold)。间隔区的序列必须与目标DNA完全匹配,以确保特异性。 4.效率评估:设计好的sgRNA...
通常,如本领域技术人员所熟知的,sgRNA包含与靶序列配对的序列(也被称为gRNA配对序列或sgRNA配对序列)、骨架(Scaffold)序列(也被称为gRNA骨架序列)和转录终止子(例如polyT)。本发明中,除非特别指出,gRNA和sgRNA可以互换使用。本文所使用的术语“gRNA骨架序列”或“骨架序列”是指sgRNA中gRNA配对序列与转录终止子之间的...
每一批sgRNA文库都通过NGS进行了检测,确保超过90%的sgRNAs在10倍分布范围以内。我们也优化了pLVXS-sgRNA-mCherry-hyg载体中的sgRNA scaffold序列,有助于加强Cas9-sgRNA之间的相互作用,实现高基因编辑效率。本系统通过使用高滴度的慢病毒包装系统Lenti-X Packaging Single Shots,可以有效维持慢病毒sgRNA文库的代表性。
这些慢病毒载体经过了自失活处理,以提高病毒制备和使用过程中的生物安全性。pLVXS-sgRNA-mCherry-hyg载体包含一个IRES连接的双顺反子表达框,可以同时表达mCherry红色荧光标记和潮霉素抗性筛选标记。sgRNAs由人U6启动子表达,包含经过优化的scaffold序列,可以高效招募Cas9,实现更高的基因编辑效率(Panel B)。
Scaffold Template 1.25 - sgRNA Oligo(10μM) 1.25 0.5μM 2×Canace Enzyme Mix 12.5 1× 注:1.Scaffold Template已预先与下游引物混合。 2. 使用试剂、容器等无RNase污染。 ②PCR反应程序: 循环步骤 温度 时间 循环数 变性 98℃ 10s 30 延伸
sgRNA的5’包括20nt的protospacer序列,该序列和靶向DNA序列互补以实现双链切割;其3’则为固定的一段具有茎环(stem-loop)结构的支架序列(scaffold sequence),该序列和Cas9蛋白带正电的凹槽相互作用形成核糖核蛋白复合物(ribonucleoprotein complex, RNP)。一般sgRNA序列大多指20nt的protospacer序列。 大部分的sgRNA设计工具...