支架区（scaffold）：结合Cas9蛋白 设计原则 靶向位点选择：位于目标基因的外显子区（若需敲除）或调控区...
sgRNA的5’包括20nt的protospacer序列,该序列和靶向DNA序列互补以实现双链切割;其3’则为固定的一段具有茎环(stem-loop)结构的支架序列(scaffold sequence),该序列和Cas9蛋白带正电的凹槽相互作用形成核糖核蛋白复合物(ribonucleoprotein complex, RNP)。一般sgRNA序列大多指20nt的protospacer序列。 大部分的sgRNA设计工具...
我们也优化了pLVXS-sgRNA-mCherry-hyg载体中的sgRNA scaffold序列,有助于加强Cas9-sgRNA之间的相互作用,实现高基因编辑效率。本系统通过使用高滴度的慢病毒包装系统Lenti-X Packaging Single Shots,可以有效维持慢病毒sgRNA文库的代表性。 应用: · 人细胞全基因组表型筛选 · 功能缺失型遗传筛选 注意事项: · ...
我们也优化了pLVXS-sgRNA-mCherry-hyg载体中的sgRNA scaffold序列,有助于加强Cas9-sgRNA之间的相互作用,实现高基因编辑效率。本系统通过使用高滴度的慢病毒包装系统Lenti-X Packaging Single Shots,可以有效维持慢病毒sgRNA文库的代表性。 应用: · 人细胞全基因组表型筛选 · 功能缺失型遗传筛选 注意事项: · Guide-...
本试剂盒提供了Cas9 Scaffold Oligo,该序列与使用者设计的Target-specific DNA Oligo部分互补,在DNA聚合酶的作用下延伸获得用于转录的dsDNA模板,然后使用本试剂盒提供的RNA聚合酶催化sgRNA合成,20µl单管反应可在0.5h-4h内获得5-25μg功能性的sgRNA。纯化后的sgRNA可以转染细胞,在表达Cas9的细胞中进行基因编辑,也...
本发明通过分别对猪CD163、MSTN基因设计基因编辑双靶位点,该靶位点均能被Cas9核酸内切酶特异性识别,从而介导双链断裂,在自我修复系统的作用下通过非同源末端连接的方式使基因发生突变,然后设计sgRNA组合物,并且以tRNA‑sgRNA‑sgRNA scaffold为最小重复单元,利用PTG/Cas9策略构建Cas9‑CD163‑MSTN多顺反子...
在现代生物技术研究中,此系统是通过人工优化的具有引导作用的sgRNA(Single Guide RNA)引导核酸酶Cas9蛋白在与sgRNA配对的靶位点处剪切双链DNA,从而引起DNA断裂。由于生物体内非同源末端修复机制或同源重组机制修复DNA,导致基因移码突变、替换或删除,致使基因功能丧失。 Hifair® Precision sgRNA Synthesis Kit采用T7 RNA...
(SEQ ID NO.8) [0048] 以构成新的质粒载体命名为pU6‑sgRNA,此质粒仅包括ori、AmpR promoter、AmpR 元件、U6 promoter、Bbs I酶切位点以及gRNA scaffold元件。 [0049] 将pU6‑sgRNA质粒用BbsⅠ酶切,酶切体系为50uL体系:BbsⅠ2uL,10X NEB Buffer5uL,质粒2ug,用双蒸水补至50uL。酶切条件:37℃酶切2h...
5)以质粒pYLsgRNA-AtU3b为模板,使用引物GF和GR扩增得到含有两个BsaI酶切位点、gRNAscaffold和终止子的片段; 6)使用AscI单酶切质粒pYLCRISPR/Cas9P-35S-N,并回收对应的片段,得到线性化的pYLCRISPR/Cas9P-35S-N; 7)将4)、5)和6)中的片段进行混合,使用pEASY-UniSeamlessCloningandAssemblyKit进行同源重组反应,取...