一、化学合成sgRNA的“核心结构”:不只是20nt靶向序列 传统认知中,sgRNA只需包含20nt靶向序列+骨架(scaffold)即可引导Cas9切割。但化学合成sgRNA的“隐形设计修饰”才是决定其稳定性和编辑效率的关键: 二、稳定递送的“分子武器库”:化学修饰的优势 三、应用场景:从实验室到临床 疾病模型构建:化学合成sgRNA助力...
连接反应:使用DNA连接酶将SqRNA和sqRNAscaffold的DNA序列插入到Cas9载体的相应位点中 4.转化和筛选阳性克...
在设计sgRNA时,必须确保目标序列紧邻PAM序列,以便Cas9蛋白能够准确识别并切割。 3.sgRNA结构设计:根据目标序列和PAM序列,设计出具有特定结构的sgRNA。这通常包括一个与目标序列互补的间隔区(spacer)和一个与Cas9蛋白结合的支架区(scaffold)。间隔区的序列必须与目标DNA完全匹配,以确保特异性。 4.效率评估:设计好的sgRNA...
sgRNA的5’包括20nt的protospacer序列,该序列和靶向DNA序列互补以实现双链切割;其3’则为固定的一段具有茎环(stem-loop)结构的支架序列(scaffold sequence),该序列和Cas9蛋白带正电的凹槽相互作用形成核糖核蛋白复合物(ribonucleoprotein complex, RNP)。一般sgRNA序列大多指20nt的protospacer序列。 大部分的sgRNA设计工具...
我们也优化了pLVXS-sgRNA-mCherry-hyg载体中的sgRNA scaffold序列,有助于加强Cas9-sgRNA之间的相互作用,实现高基因编辑效率。本系统通过使用高滴度的慢病毒包装系统Lenti-X Packaging Single Shots,可以有效维持慢病毒sgRNA文库的代表性。 应用: · 人细胞全基因组表型筛选 · 功能缺失型遗传筛选 注意事项: · ...
每一批sgRNA文库都通过NGS进行了检测,确保超过90%的sgRNAs在10倍分布范围以内。我们也优化了pLVXS-sgRNA-mCherry-hyg载体中的sgRNA scaffold序列,有助于加强Cas9-sgRNA之间的相互作用,实现高基因编辑效率。本系统通过使用高滴度的慢病毒包装系统Lenti-X Packaging Single Shots,可以有效维持慢病毒sgRNA文库的代表性。
随后进行了不同tRNA的功能验证,在进行spacer-scaffold-tRNA-spacer (SSTS) 单元的合成实验时发现,重复序列导致的PCR效率降低,当使用单一的sgRNA scaffold或tRNAs进行SSTS单元的合成时,由于模板中存在多个相同的重复序列,可能会在PCR过程中产生重组,这大大降低了PCR的效率;融合PCR的复杂性,在使用融合PCR进行SSTS单元的合...
专利摘要:本发明提供了一种快速筛选sgRNA骨架sgRNAscaffold活性突变体序列的系统和方法,属于生物工程技术领域。所述体系包含Cas蛋白表达载体和sgRNA骨架突变体筛选载体;所述Cas蛋白表达载体上包含以下表达元件:Cas蛋白编码基因、质粒复制子、以及第一抗性筛选标签表达盒;所述sgRNA骨架突变体筛选载体包含以下表达元件:复制子、...
插入基因名称: sgRNA scaffold 物种来源: -- 插入大小: -- 基因突变: -- GenBank编号 -- 启动子 -- 标签/融合蛋白: -- 克隆方法: 限制性内切酶 5' 克隆位点: AgeI(未破坏) 3' 克隆位点: NotI (未破坏) 5' 测序引物 CMV-F 3' 测序引物 SV40pA-R 文献引用方法 材料和方法部分: pUC57-sgRNA expr...
这些慢病毒载体经过了自失活处理,以提高病毒制备和使用过程中的生物安全性。pLVXS-sgRNA-mCherry-hyg载体包含一个IRES连接的双顺反子表达框,可以同时表达mCherry红色荧光标记和潮霉素抗性筛选标记。sgRNAs由人U6启动子表达,包含经过优化的scaffold序列,可以高效招募Cas9,实现更高的基因编辑效率(Panel B)。