为了减少由于扩增引起的误差,人们在一些单细胞测序的步骤中增加了UMI(unique molecular identifiers),UMIs 是由4-10 个随机核苷酸组成的序列组成,在 mRNA 反转录后,加入到文库中,每一个 mRNA随机连上一个 UMI,因此可以计数不同的 UMI达到计数 mRNA 数量的目的。 二、单细胞RNA-seq扩增技术的选择 如果我们想了解不...
收集GEMs,并将其全部混合,凝胶珠在每个油滴内自动溶解释放大量Barcode引物序列,细胞裂解释放mRNA,mRNA与逆转录酶、凝胶珠上的poly dT反转录引物以及dNTP底物相接触,在逆转录酶的作用下发生逆转录反应,产生用于测序的带有Barcode和UMI信息的cDNA一链,再以SMART扩增方法完成第二链合成。 cNDA片段化油滴破碎,磁珠纯化cDNA...
4.聚类分析是单细胞RNA-Seq中不可或缺的一部分,它有助于确定细胞和了解细胞之间的相互关系和功能。 一、普通转录组测序(Bulk RNA-Seq)与单细胞测序(scRNA-Seq) (1)普通转录组测序(Bulk RNA-Seq) 普通转录组测序(Bulk RNA-seq)是提取组织、器官、群细胞的Total RNA进行测序,用于分析组织或细胞总体的RNA组成。
1️⃣ 首先我们要搞清楚scRNA-seq都有哪些产物。👇 cDNA片段 (识别转录本); Cell barcode(CB,识别细胞); Unique Molecular Identifier(UMI,减小PCR扩增带来的bias)。 2️⃣ 典型的scRNA-seq的workflow包括以下几个步骤:👇 将cDNAmapping到reference上; 计算基因reads; 计算细胞reads(用到cell barcode); ...
GEMs 的结构确保了>90% 的油滴内反应产物都可以顺利用唯一的 barcode 分子标记。Gel bead由凝胶珠和磁珠上的一段引物构成。Gel bead上连接的引物序列包含四个部分:Illumina TruSeq Read 1测序引物、16 nt的条形码(Barcode)、12 nt的UMI和30 nt的Poly(dT)反转录引...
图1b展示了scRCAT-seq2的具体流程,主要包括以下步骤:(1)使用唯一分子标识符(UMI)标记单个RNA/cDNA分子的末端;(2)通过端到端连接构建环状cDNA;(3)进行滚环扩增,以生成多个全长cDNA的拷贝;(4)使用Tn5转座酶在环状全长cDNA上随机插入,将其片段化;(5)构建文库并对片段进行双端测序;(6)整合具有相同UMI的短读...
逆转录和扩增:使用逆转录酶将RNA转化为cDNA,通常通过PCR或者体外扩增(IVT)进行扩增,以增加信号强度和覆盖度。这个步骤中利用了UMI技术,将每个mRNA条形码化,以辨识细胞中的每个单独的mRNA。 构建文库和测序:使用特定的方法或平台将cDNA构建成文库,并进行高通量测序,以获得每个细胞的基因表达数据。
SCRB-seq与Smart-seq相似,均是通过PCR的方式对扩增cDNA进行扩增。 但与Smart-seq不同的是,SCRB采用UMI主要对 RNA 3'进行富集,而Smart-seq对mRNA的全长进行分析,两者还是不一样的。 SCRB-seq的主要流程: 图片来源:【豪克博士聊科研】教你单细胞测序(五)操作流程(4) - 知乎 ...
nCount_RNA:每个细胞的UMI号 nFeature_RNA:每个细胞检测到的基因数量 读取多个样本`for loop` 在实践中,一般可能需要读取几个样本,同样使用我们前面讨论的两个函数(read10X()或readMM())中的一个来读入数据。为了更有效地将数据导入到R中,我们可以使用for循环,该循环将对给定的每个输入执行一系列命令。 在R中...
在 scRNA-seq 的 33,162 个细胞中总共检测到 2 亿个转录本和 33,408 个基因。将细胞分为 9 簇,EC 细胞来源于上皮细胞和纤毛细胞。基因集变异分析 (GSVA) 表明,上皮细胞和内皮细胞亚簇中富集的通路存在显著差异,表明 EC 具有很大的异质性。细胞间通讯分析表明,EC 细胞发出的信号最强,内皮细胞比其他细胞...