RT-PCR操作步骤 RT-PCR步骤 一、总RNA提取 1. 取200mg组织，放到1.5mlEP管中，加入1mlTrizol剪碎。2. 震荡30s。3. 加0.2ml氯仿，剧烈摇动30s，室温3min。4. 12000×g，4℃离心，15min。5. 吸上层无色水相，移入另一EP管中（约0.5ml）。6. 加等体积异丙醇，-20℃，30min。7. 12000×g，4℃离心...
1. 做RT前必需测RNA浓度,逆转录体系对RNA量还是有一些要求,常用500ng或1ug。 2. RT按要求做,一般不会出太大问题。 3. PCR如需扩长片段,则对前两步要求较高,需要有完整的cDNA存在,不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。 试验过程: 实验器具: 1、 移液枪:1ml、200μl、20μl、10μl、2μl 2、...
逆转录RT-PCR把以RNA为模板的cDNA合成(即 RNA的反转录)与cDNA 的 PCR 结合在一起,提供了一种基因表达检测、定量和 cDNA克隆的快速灵敏的方法。由于 cDNA 包括了编码蛋白的完整序列,而且不含内含子,只要略经改造便可直接用于基因工程表达和功能研究,因此RT-PCR成为目前获得目的基因的一种重要手段。 首先是在逆转...
RT-PCR实验操作步骤 (转) 默认分类2007-12-25 17:51:05阅读233评论1字号:大中小订阅 一.所用试剂 1.0.01MPBS缓冲液,PH7.4 :高压灭菌,40C保存。临用前-200C放置30分钟,确保冰冷。 2.焦碳酸二乙酯(DEPC):sigma公司,40C保存。 3.0.1%DEPC处理的灭菌去离子水:100ml去离子水中加入0.1mlDEPC,剧烈振荡混匀...
第二步 RT-PCR操作步骤 一、RNA逆转录cDNA(反应体系要20ul)依次加入 1、Oligo(dT)加入1ul。 2、RNA(体积即上一步骤计算出来的) 3、剩下的用无Rnase水补齐共12ul 65℃水浴5min。 二、加入逆转录试剂 1、5×Reaction Buffer 4ul 2、Ribolock RNase Inhibiter 1ul ...
RT-PCR技术操作流程 简介 RT-PCR是利用反转录酶催化dNTPs聚合成与mRNA模板互补的单链DNA(即cDNA)，以cDNA为模板在PCR反应系统中进行扩增，然后通过琼脂糖凝胶电泳法检测RT-PCR产物，从而间接检测mRNA的方法。工具/原料 PCR仪、台式离心机、低温高速离心机、旋涡混匀器、稳压稳流电泳仪、水平电泳槽、紫外凝胶分析系统等...
逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Tranion-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR) 的原理是:提取组织或细胞中的总 RNA,以其中的 mRNA 作为模板,采用 Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成 cDNA。再以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增,而获得目的基因或检测基因表达。
RT-PCR操作规程 一,提取RNA 1.取中号培养瓶(100ml培养瓶注:此时细胞汇合度≥80%),用PBS洗细胞两次,弃尽PBS,再加入约1ml PBS,用细胞刮子将细胞刮下,将细胞悬液加入1.5 mlEP管,常温,5000rpm2分钟,弃尽上清。加0.5mlTRIzol,剧烈震荡(TRIzol由粘稠状变为清亮,仍为粉红色)。
优势:RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级,使一些极为微量的RNA样品分析成为可能。 02 仪器与设备 材料:提取RNA样品,如新鲜组织、培养细胞。 试剂:RNA提取试剂,(见文章:试验教程 | RNA提取)、DEPC处理水、Money鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶、5×反转录缓冲液、oligo(dT)12~18、第一链cDNA合成试剂盒、dNTP...