RT-PCR操作步骤 RT-PCR步骤 一、总RNA提取 1. 取200mg组织，放到1.5mlEP管中，加入1mlTrizol剪碎。2. 震荡30s。3. 加0.2ml氯仿，剧烈摇动30s，室温3min。4. 12000×g，4℃离心，15min。5. 吸上层无色水相，移入另一EP管中（约0.5ml）。6. 加等体积异丙醇，-20℃，30min。7. 12000×g，4℃离心...
一、 逆转录的关键步骤是当即冰水浴。 二、 Rt时,先打开PCR预热30分钟。 3、 RNA抽提早,打开离心机预冷。 4、 在所有RNA实验中,最关键的因素是分离取得全长的RNA。而实验失败的要紧缘故是核糖核酸酶(RNA酶)的污染。在实验中,一方面要严格操纵外源性RNA酶的污染;另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶。RNA...
先将1-10μl左右PCR产物,加已点在纸上的溴酸兰,反复吸打混匀后进行电泳,一般电流为10mA,电源100V,电泳30分钟,紫外灯下观察。 注意事项: 1、 逆转录的关键步骤是立即冰水浴。 2、 Rt时,先打开PCR预热30分钟。 3、 RNA抽提前,打开离心机预冷。 4、 在所有RNA实验中,最关...
一、RT-PCR操作步骤 1. RNA抽提 方法:TRlzol法。 主要成分:苯酚(具有裂解细胞和变性蛋白的作用)。 RNA抽提前准备:试剂耗材准备(注意RNase free)、样品的准备。 步骤:样品+1ml TRlzol室温裂解10min+200μL氯仿振荡30s后室温静置2-3 min;4℃低温离心(12 000g×20min);400μL上层水相+600μL异丙醇室温沉淀10...
步骤 1.提取RNA:RT-PCR的第一步是从样品中提取RNA。常见的方法包括酚/氯仿提取法和商用RNA提取试剂盒。 2.逆转录:逆转录是将RNA转录成cDNA的过程。逆转录反应需要逆转录酶和引物。在逆转录反应中,RNA被逆转录酶逆转录为单链cDNA。 3.退火:将逆转录产生的单链cDNA进行退火,以得到双链cDNA。退火的温度和时间应...
1．在整个操作过程中，应避免RNA酶的污染，所用器材都需经特殊处理，另注意温度的调控，避免RNA的降解或失活。2．抽提总RNA时应小心吸取上层水相转入EP管，注意勿吸取水相与有机相的界面层，此层含有DNA及蛋白质，会对PCR扩增有影响。3．采用热启动PCR可减少非特异性PCR产物和引物二聚体的生成。4．不同公司所...
下面将介绍RT-PCR的操作流程。 首先,准备实验所需的试剂和设备,包括RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、PCR试剂盒、热循环仪等。确保所有试剂和设备都处于干净、无菌状态。 第二步是提取RNA样本。将待检测的样本(如血液、组织等)加入RNA提取试剂盒中,按照试剂盒说明书的指导进行RNA提取。提取后的RNA样本应该是纯净的,...
实验步骤 一、总RNA的提取 总RNA提取可以:(1)获得高纯度、高质量的总RNA;(2)可以满足生物学下游实验Northern Blot、核酸酶保护实验、RT-PCR、qRT-PCR 和阵列分析所需。 二、cDNA第一链的合成 目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售,其原理基本相同,但操作步骤不一。现以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamp...