Ct 值(Ct value):Ct值就是荧光值达到阈值时候的PCR循环次数,跟初始模板的量呈反比。下面我们从荧光标记方法、详细实验步骤和常见问题分析三个方面来详细讲解RT-qPCR。图1.基线、标准偏差和荧光阈值示意图 一、荧光标记方法 RT-qPCR是通过检测反应体系中的荧光强度来检测PCR扩增产物的,其荧光标记方法分为两种:...
RT-qPCR 的 Ct 值偏大主要有两种情况,一种是所有基因 Ct 都偏大,另外一种是个别基因 Ct 偏大。 所有基因 Ct 偏大 如果前期所做基因均已做过预实验,Ct 值正常,而本次实验,所有基因扩增 Ct 值都偏大,那很可能是模板质量的原因,如发生了降解,浓度不纯...
(1) 准备反应体系:模板 DNA 或经过逆转录得到的 cDNA、引物 (正、反向)、荧光染料 (如 SYBR Green) 或探针 (如 Taq man 探针、qPCR 探针等)、dNTPs (dATP、dTTP、dCTP、dGTP)、PCR 反应缓冲液 (提供合适的 pH 和离子强度)、耐高温 Taq DNA 聚合酶或专用的荧光 PCR 聚合酶、去离子水等。也可直接使...
在荧光定量PCR技术中,有一个很重要的概念--Ct值。C代表Cycle,t代表threshold,Ct值的含义是:每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。在RT-qPCR中,对扩增过程进行实时监测,根据反应时间和荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。图2:图片来源于网络,若有侵权联系删除 整条曲线可以分为3个阶段:...
图1.qPCR检测结果△Ct<1,且 Ct 值与 Nanodrop 定量结果无线性关系 因此,cDNA浓度的测定值是不准确的,逆转录实验之后无需测定浓度。RT-qPCR是一个多步骤连贯实验,正是因为cDNA无法鉴定,只能通过后续qPCR实验才能呈现结果。 2 gDNA污染的识别与去除 gDNA的污染主要来源于RNA模板, 那如何识别RNA模板中是否仍含有gDNA...
RT-qPCR结果的判读通常遵循以下标准: 1.阈值循环(Threshold Cycle,Ct值): - Ct值是指达到检测阈值时的循环次数,它反映了样本中目标RNA的初始浓度。 - Ct值越低,表示目标RNA的浓度越高。 -通常,Ct值低于某个特定值(如30或35)被认为是阳性结果,高于这个值则认为是阴性结果。 2.相对表达量: -相对表达量是...
实时荧光定量PCR,即Real-Time PCR,即第二代PCR,是指在PCR扩增反应体系中加入荧光染料或者荧光基团,在整个PCR反应过程中通过收集荧光信号来实时监测每一个循环中扩增产物量的变化,最后通过CT值和标准曲线对待测检测样品进行定量分析。qPCR在聚合酶链反...
在RT-qPCR的实验过程中,大家或多或少都会遇到扩增曲线异常、熔解曲线异常、重复性差等问题。小翊给大家整理了SYBR Green染料法的常见问题及解决方案,以供大家参考。 Part 1 扩增曲线异常 正常的扩增曲线一般呈S型,Ct值最好在20-30之间。异常的扩增曲线包括Ct值偏大、无平台期、平台期下降等问题。
qPCR的扩增曲线与荧光阈值交点对应的横坐标就是循环数(Ct)值。Ct值越低证明样本中靶标越多。从qPCR的曲线中可以看出,在基线期,没有明显的荧光信号。随着循环数的增加,荧光信号逐渐增强。在平台期,因酶活降低或dNTP被消耗殆尽,曲线趋于平缓。 图4. qPCR扩增曲线...