RT-qPCR 的 Ct 值偏大主要有两种情况,一种是所有基因 Ct 都偏大,另外一种是个别基因 Ct 偏大。 所有基因 Ct 偏大 如果前期所做基因均已做过预实验,Ct 值正常,而本次实验,所有基因扩增 Ct 值都偏大,那很可能是模板质量的原因,如发生了降解,浓度不纯...
- 检查MeltCurve是否为单峰且光滑。 - 确保ct值在1c9值范围内,且组内差距在0.3-0.5之间。 - 内参ct值应在18-20之间,目的基因ct值应在25-35之间(大于35的ct值可视为不可用)。 - 检查扩增曲线是否到达平台期且是否光滑。 - 如上述条件均满足,即可使用Excel进行进一步分析。🔬 现在,你已经掌握了RT-qPCR实验...
其中,E1:目的基因引物扩增效率;E2:内参基因引物扩增效率;△Ct1:实验组目的基因Ct值差;△Ct2:对照组目的基因Ct值差。(E1=E2=1时,该公式=2-△△Ct) 双标准曲线法:每次实验都要分别用标准品做内参基因和目的基因的标准曲线,并同时扩增各待测样本中的目的基因和内参基因。然后使用标准曲线来计算待测样本中的目的...
本人在做荧光定量PCR,选取16srRNA作为内参,定量该株细菌某个次生代谢产物的基因表达量。 结果,内参的CT值很低,在5-15之间,大部分处理都是在10以下,而此生代谢产物那个基因的CT值在15-25之间。这种情况正常么? 请各位路过的大神指教啊~!不甚感激!!! 返回小木虫查看更多分享...
•每个模板的Ct值与该模板起始拷贝数的对数存在线性关系:起始拷贝数越多,Ct值越小。 标准曲线: 溶解曲线: 4.2 如何判断qPCR是否准确可信 通过扩增曲线、线性度-吻合度、线性范围-稀释梯度、灵敏度、特异性和重复度,判断qPCR的结果。 线性范围:5~9稀释梯度• 可以准确定量的模板浓度范围• 同时定量高拷贝和低...
第一次做RT-PCR,过程中遇见一些问题希望各位大侠帮忙解决一下!我做相对定量RT-PCR,实验过程中发现,内参基因16sCT值为14,目标基因C值在25左右,我的内参基因CT值过小怎么办,这样的数据是不是不能用,我将模板进行了1:300稀释,CT值变化不是很大,如果进行1:1000稀释的话
e.对于一些目的基因,选择一步法RT-qPCR和两步法RT-qPCR也会造成结果的不一致; f.许多商业化热启动Taq在热启动前似乎没有经制造商的封闭性测试,容易产生非特异性扩增,形成引物二聚体; g.目的基因和内参基因的扩增效率不在线性范围内,而且二者的扩增效率也不一致,这极大影响了实验结果的真实性。
没想到,我的所有实验操作视频中,播放冠军是RT-PCR(qPCR)。视频链接:https://www.bilibili.com/video/BV1kh411o7kM 我本来以为这个实验,各家出品逆转录和PCR试剂的公司,都有非常详尽的说明书,照着说明书一步一步的做下去,不会有什么问题的。 ---问题分割线--- 这几天,收集整理...
Ct值没有问题。扩曾效率要有相对的标准曲线（等比稀释样本）才能算