RT-qPCR 的 Ct 值偏大主要有两种情况,一种是所有基因 Ct 都偏大,另外一种是个别基因 Ct 偏大。 所有基因 Ct 偏大 如果前期所做基因均已做过预实验,Ct 值正常,而本次实验,所有基因扩增 Ct 值都偏大,那很可能是模板质量的原因,如发生了降解,浓度不纯...
Ct 值（Ct value）：Ct值就是荧光值达到阈值时候的PCR循环次数，跟初始模板的量呈反比。下面我们从荧光标记方法、详细实验步骤和常见问题分析三个方面来详细讲解RT-qPCR。图1.基线、标准偏差和荧光阈值示意图 一、荧光标记方法 RT-qPCR是通过检测反应体系中的荧光强度来检测PCR扩增产物的，其荧光标记方法分为两种：...
RT-qPCR结果的判读通常遵循以下标准: 1.阈值循环(Threshold Cycle,Ct值): - Ct值是指达到检测阈值时的循环次数,它反映了样本中目标RNA的初始浓度。 - Ct值越低,表示目标RNA的浓度越高。 -通常,Ct值低于某个特定值(如30或35)被认为是阳性结果,高于这个值则认为是阴性结果。 2.相对表达量: -相对表达量是...
在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念--Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。在RT-qPCR中，对扩增过程进行实时监测，根据反应时间和荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。图2：图片来源于网络，若有侵权联系删除 整条曲线可以分为3个阶段：...
图1.qPCR检测结果△Ct<1,且 Ct 值与 Nanodrop 定量结果无线性关系 因此,cDNA浓度的测定值是不准确的,逆转录实验之后无需测定浓度。RT-qPCR是一个多步骤连贯实验,正是因为cDNA无法鉴定,只能通过后续qPCR实验才能呈现结果。 2 gDNA污染的识别与去除 gDNA的污染主要来源于RNA模板, 那如何识别RNA模板中是否仍含有gDNA...
Ct 值 (Cycle threshold，循环阈值)，是指 qPCR 反应中荧光信号达到设定阈值时对应的循环数 (一般 Ct 值在 20-30 之间)。扩增曲线 (Amplification curve) 是指随 PCR 反应进行，根据荧光信号强度随着循环数变化而绘制的曲线。正常的扩增曲线 (S 型) 包括四个阶段：基线期、指数增长期、线性增长期、平台期。熔...
qPCR的扩增曲线与荧光阈值交点对应的横坐标就是循环数(Ct)值。Ct值越低证明样本中靶标越多。从qPCR的曲线中可以看出,在基线期,没有明显的荧光信号。随着循环数的增加,荧光信号逐渐增强。在平台期,因酶活降低或dNTP被消耗殆尽,曲线趋于平缓。 图4. qPCR扩增曲线...
在RT-qPCR的实验过程中,大家或多或少都会遇到扩增曲线异常、熔解曲线异常、重复性差等问题。小翊给大家整理了SYBR Green染料法的常见问题及解决方案,以供大家参考。 Part 1 扩增曲线异常 正常的扩增曲线一般呈S型,Ct值最好在20-30之间。异常的扩增曲线包括Ct值偏大、无平台期、平台期下降等问题。
(dat_treat,dat_control,by="Target_Name")dat_double_delta$CT_delta_delta<-with(dat_double_delta,CT_delta-Delta_CT_control_mean)# step4: 基于对照组检测基因的平均Δ值,计算实验组的2-ΔΔCt值dat_double_delta$qPCR<-2^-(dat_double_delta$CT_delta_delta)# step5: 条形图或相关性散点图...